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链霉菌实验操作
不同公司不同的酶要求的反应体系与反应条件会有不同,PCR反应可参考该酶的产品说明上的反应体系与反应条件。
一般的反应体系如:
引物(50pmol/μl) 各1μl     反应终浓度: 各1pmol/μl
模板(约30ng/μl) 1μl 约30ng
Buffer(10´, 含Mg2+) 5μl 1´
dNTPs(10mM) 1μl 0.2μM
高温聚合酶(5U/μl) 0.2~1μl 1-5U
ddH2O    
总体积 50μl
   

PCR反应参考程序:
――――――――――――――――时间
Step 1   预变性     95-96℃       3-8min
Step2    变性       94℃         50sec
Step3     复性       *          50sec
Step4     延伸       72℃        *
Step5    2、3、4步骤循环(25次左右);
Step6     延伸        72℃        10 min
4℃结束反应(4度长时间保温对PCR仪有较大损伤,一般不超过1小时便及时取出,绝对不允许过夜保温)。
 
注:
                 引物应该用专门的软件(如Primer Premier)认真设计,注意两条引物的Tm值大致相等,GC含量较均一,引物自身以及之间不形成强的二级结构,特别是引物的3’ 端,引物不和模板其他位置形成强的配对(主要看引物3’端)。
                 MgCl2浓度依不同的模板和引物而定。MgCl2的浓度对PCR结果影响很大。
                 链霉菌的PCR因模板的GC含量高,可加DMSO(能降低复性温度)其浓度可在0~10%之间变化。
                 模板为环形质粒时若一次没有扩增出来,可以考虑先用酶将其切成线性再作。
                 对高GC含量的模板,预变性的时间也可适当延长,甚至先在沸水中煮5分种,然后迅速放入冰中。如果使用预变性温度高或时间长,一般要使用“热启动”,即在预变性后再加入酶,这样一是可以保护酶,二是可以避免低温时酶的非特异性扩增。
                 现在的PCR仪一般都有“热盖”装置,可以代替原来使用的矿物油,避免PCR过程中水份蒸发到管盖上。
                 复性温度依引物Tm值及引物与模板的匹配程度而定,提高复性温度可提高扩增的特异性,而当无扩增条带时,可适当降低复性温度。
                 延伸时间可根据扩增区域的长度确定,扩增区域越长,延伸时间越长。不同的聚合酶的延伸速度不一样,具体看说明书,一般高保真聚合酶平均每分钟延伸600bp,普通Taq酶每分钟延伸1kb。
                 根据不同需要使用不同的聚合酶,尤其当用于扩增表达的基因序列时,一定要使用高保真的酶,作普通的PCR验证时就可用普通Taq酶。以链霉菌或其他高GC含量的DNA作模板时,由于GC含量越高,模板和引物的二级结构越复杂,延伸和配对越难,PCR反应不好做,可以暂时(2003年7月-)用TaKaRa的La Taq酶作普通的PCR,保真度不敢保证,但扩增效果很好。酶的用量可参考说明书,并不是越多越好。
                 LA Taq酶的GC buffer往往能用于别的酶(如普通Taq酶或高保真酶probest),使它们也能很容易地扩出高G+C的模板来。
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