前言
本标准代替 GB/T 4789.38-2008《食品卫生微生物学检验大肠杆菌计数》。
本标准与 GB/T 4789.38-2008 相比，主要变化如下：
——修改了标准的中文名称；
——修改了培养基和试剂；
——将“第二法大肠杆菌 VRB-MUG 平板计数法”改为“大肠埃希氏菌平板计数法（第二法）”；
——删除了“第三法大肠杆菌 PetrifilmTM测试片计数法”；
——修改了附录 A。
食品安全国家标准
食品微生物学检验 双歧杆菌检验
1 范围
本标准规定了食品中大肠埃希氏菌（Escherichia coli）计数的方法。
本标准适用于食品中大肠埃希氏菌的计数，其中大肠埃希氏菌平板计数法（第二法）不适用于贝类产
品。
2?术语和定义
2.1大肠埃希氏菌 Escherichia coli 大肠杆菌 广泛存在于人和温血动物的肠道中，能够在44.5℃发酵乳糖产酸产气，IMViC（靛基质、甲基红、VP
试验、柠檬酸盐）生化试验为＋＋－－或－＋－－的革兰氏阴性杆菌。以此作为粪便污染指标来评价食品
的卫生状况，推断食品中肠道致病菌污染的可能性。
2.2最可能数
基于泊松分布的一种间接计数方法，简称为MPN。
3设备和材料
除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：
a）恒温培养箱：36℃±1℃；
b）冰箱：2℃～5℃；
c）恒温水浴箱：44.5℃±0.2℃；
d）天平：感量为 0.1 g；
c）均质器；
d）振荡器；
e）无菌吸管：1 mL（具0.01 mL 刻度）、10 mL（具0.1 mL 刻度）或微量移液器及吸头；
f）无菌锥形瓶：容量500 mL；
g）无菌培养皿：直径90 mm；
h）pH 计或 pH 比色管或精密 pH 试纸；
i）菌落计数器；
j）紫外灯：波长 360 nm～366 nm，功率≤6 W。
4培养基和试剂
4.1月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤：见附录 A 中 A.1。
4.2EC 肉汤（E.coli broth）：见附录 A 中 A.2。
4.3蛋白胨水：见附录 A 中 A.3。
4.4缓冲葡萄糖蛋白胨水[甲基红(MR)和 V-P 试验用]：见附录 A 中 A.4。
4.5西蒙氏柠檬酸盐培养基：见附录 A 中 A.5。
4.6磷酸盐缓冲液：见附录 A 中 A.6。
4.7伊红美蓝（EMB）琼脂：见附录 A 中 A.7。
4.8营养琼脂斜面：见附录 A 中 A.8。
4.9结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA）：见附录 A 中 A.9。
GB 4789.38-2012
4.10结晶紫中性红胆盐-4-甲基伞形酮-β-D-葡萄糖苷琼脂（VRBA-MUG）：见附录 A 中 A.10。
4.11革兰氏染色液：见附录 A 中 A.11。
4.12Kovacs 靛基质试剂：见附录 A 中 A.12。
4.13无菌 1 mol/L NaOH：见附录 A 中 A.13。
4.14无菌 1 mol/L HCl：见附录 A 中 A.14。
5大肠埃希氏菌 MPN 计数（第一法）
5.1检验程序
大肠埃希氏菌MPN计数的检验程序见图1。
5.2操作步骤
5.2.1样品的稀释
5.2.1.1固体和半固体样品：称取25g样品，放入盛有 225 mL 磷酸盐缓冲液的无菌均质杯内，8 000
r/min～10 000 r/min 均质1min～2 min，制成 1:10 样品匀液，或放入盛有 225 mL 磷酸盐缓冲液的无菌均质
袋中，用拍击式均质器拍打1min～2 min 制成 1:10 的样品匀液。
5.2.1.2液体样品：以无菌吸管吸取 25 mL 样品置盛有 225 mL 磷酸盐缓冲液的无菌锥形瓶（瓶内预置适
当数量的无菌玻璃珠）中，充分混匀，制成 1:10 的样品匀液。
5.2.1.3样品匀液的 pH 值应在 6.5～7.5 之间，必要时分别用 1 mol/L NaOH 或 1 mol/L HCl 调节。
5.2.1.4用 1 mL 无菌吸管或微量移液器吸取 1:10 样品匀液 1 mL，沿管壁缓缓注入 9 mL 磷酸盐缓冲液
的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管或换用 1 支 1 mL 无菌吸管或吸头反复
吹打，使其混合均匀，制成 1:100 的样品匀液。
5.2.1.5根据对样品污染状况的估计，按上述操作，依次制成10倍递增系列稀释样品匀液。每递增稀释1
次，换用1支1 mL无菌吸管或吸头。从制备样品匀液至样品接种完毕，全过程不得超过15 min。
5.2.2 初发酵试验
每个样品，选择 3 个适宜的连续稀释度的样品匀液（液体样品可以选择原液），每个稀释度接种 3 管
月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤，每管接种 1 mL（如接种量超过 1 mL，则用双料 LST 肉汤），36 ℃±1 ℃
培养 24 h±2 h，观察小倒管内是否有气泡产生，24 h±2 h 产气者进行复发酵试验，如未产气则继续培养 48 h±2
h。产气者进行复发酵试验。如所有 LST 肉汤管均未产气，即可报告大肠埃希氏菌 MPN 结果。
5.2.3 复发酵试验
用接种环从产气的 LST 肉汤管中分别取培养物 1 环，移种于已提前预温至 45 ℃的 EC 肉汤管中，放
入带盖的 44.5 ℃±0.2 ℃水浴箱内。水浴的水面应高于肉汤培养基液面，培养 24 h±2 h，检查小倒管内是否
有气泡产生，如未有产气则继续培养至 48 h±2 h。记录在 24 h 和 48 h 内产气的 EC 肉汤管数。如所有 EC
肉汤管均未产气，即可报告大肠埃希氏菌 MPN 结果；如有产气者，则进行 EMB 平板分离培养。
5.2.4伊红美蓝平板分离培养
轻轻振摇各产气管，用接种环取培养物分别划线接种于 EMB 平板，36 ℃±1 ℃培养 18 h～24 h。观察
平板上有无具黑色中心有光泽或无光泽的典型菌落。
5.2.5营养琼脂斜面或平板培养
从每个平板上挑 5 个典型菌落，如无典型菌落则挑取可疑菌落。用接种针接触菌落中心部位，移种到
营养琼脂斜面或平板上，36 ℃±1 ℃，培养 18 h～24 h。取培养物进行革兰氏染色和生化试验。
5.2.6 鉴定
取培养物进行靛基质试验、MR-VP 试验和柠檬酸盐利用试验。大肠埃希氏菌与非大肠埃希氏菌的生
化鉴别见表 1。
5.3大肠埃希氏菌 MPN 计数的报告
大肠埃希氏菌为革兰氏阴性无芽胞杆菌，发酵乳糖、产酸、产气，IMViC 生化试验为＋＋――或－＋
－－。只要有 1 个菌落鉴定为大肠埃希氏菌，其所代表的 LST 肉汤管即为大肠埃希氏菌阳性。依据 LST
肉汤阳性管数查 MPN 表（见附录 B），报告每 g（mL）样品中大肠埃希氏菌 MPN 值。
6大肠埃希氏菌平板计数法（第二法）
6.1检验程序
大肠埃希氏菌平板计数法的检验程序见图2。
6.2操作步骤
6.2.1样品的稀释
按5.2.1进行。
6.2.2平板计数
6.2.2.1选取 2 个～3 个适宜的连续稀释度的样品匀液，每个稀释度接种 2 个无菌平皿，每皿 1 mL。同时
取 1 mL 稀释液加入无菌平皿做空白对照。
6.2.2.2将10 mL～15 mL 冷至45? ℃±0.5? ℃的结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA）倾注于每个平皿中。小心
旋转平皿，将培养基与样品匀液充分混匀。待琼脂凝固后，再加3 mL～4 mL? VRBA-MUG覆盖平板表层。
凝固后翻转平板，36? ℃±1? ℃培养18 h～24 h。
6.3平板菌落数的选择
选择菌落数在10 CFU～100 CFU之间的平板，暗室中360 nm～366 nm? 波长紫外灯照射下，计数平板
上发浅蓝色荧光的菌落。
检验时用已知MUG阳性菌株（如大肠埃希氏菌? ATCC 25922）和产气肠杆菌（如ATCC 13048）做阳
性和阴性对照。
6.4大肠埃希氏菌平板计数的报告
两个平板上发荧光菌落数的平均数乘以稀释倍数，报告每g（mL）样品中大肠埃希氏菌数，以CFU/g (mL)
表示。若所有稀释度（包括液体样品原液）平板均无菌落生长，则以小于1乘以最低稀释倍数报告。
|
