李斯特氏菌检验-检验步骤 GB/T 4789.30-2008

第一法常规培养方法

4 检验程序
单核细胞增生李斯特氏菌检验见程序图 。

5 操作步骤
5.1 增菌
以无菌操作取样品25g（或25mL）加人到含有225mL LB1 增菌液的均质袋中，在拍击式均质器上连续均质1 min- 2 min ；或放人盛有225mL LB ，增菌液的均质杯中，8000r/min-1000r/min 均质1 min-2 min 。于30℃±1℃ 培养24h ，移取0.1mL ，转种于10mLLB ：增菌液内，于30℃±l℃ 培养18h-24h 。
5.2 分离
取LB2 二次增菌液划线接种于PALCAM 琼脂平板和李斯特氏菌显色琼脂平板上，于36℃±1℃ 培养24h-48h ，观察各个平板上生长的菌落。典型菌落在科玛嘉李斯特氏菌显色琼脂平板上为小的圆形蓝色菌落，周围有白色晕圈；在PALCAM 琼脂平板上为小的圆形灰绿色菌落，周围有棕黑色水解圈，有些菌落有黑色凹陷。
5.3 初筛
自选择性琼脂平板上分别挑取5 个以上典型或可疑菌落，分别接种在木糖、鼠李糖发酵管，于36℃±1℃ 培养24h ；同时在TSA-YE 平板上划线纯化，于30℃±1℃ 培养24h-48h 。选择木糖阴性、鼠李糖阳性的纯培养物继续进行鉴定。
5.4 鉴定
5.4.1 染色镜检：李斯特氏菌为革兰氏阳性短杆菌，大小为（0.4μm-0.5μm) × ( 0.5μm-2.0μm )；用生理盐水制成菌悬液，在油镜或相差显微镜下观察，该菌出现轻微旋转或翻滚样的运动。
5.4.2 动力试验：李斯特氏菌有动力，呈伞状生长或月牙状生长。
5.4.3 生化鉴定：挑取纯培养的单个可疑菌落，进行过氧化氢酶试验，过氧化氢酶阳性反应的菌落继续进行糖发酵试验和MR-VP 试验。单核细胞增生李斯特氏菌的主要生化特征见表1 。
表1 单核细胞增生李斯特氏菌生化特征与其他李斯特氏菌的区别
5.4.4 溶血试验：将羊血琼脂平板底面划分为20 个-25 个小格，挑取纯培养的单个可疑菌落刺种到血平板上，每格刺种一个菌落，并刺种阳性对照菌（单核细胞增生李斯特氏菌和伊氏李斯特氏菌）和阴性对照菌（英诺克李斯特氏菌），穿刺时尽量接近底部，但不要触到底面，同时避免琼脂破裂，36℃±1℃ 培养24h-48h ，于明亮处观察，单核细胞增生李斯特氏菌和斯氏李斯特氏菌在刺种点周围产生狭小的透明溶血环，英诺克李斯特氏菌无溶血环，伊氏李斯特氏菌产生大的透明溶血环。
5.4.5 协同溶血试验（CAMP ) ：在羊血琼脂平板上平行划线接种金黄色葡萄球菌和马红球菌，挑取纯培养的单个可疑菌落垂直划线接种于平行线之间，垂直线两端不要触及平行线，于30℃±1℃ 培养24h-48h 。单核细胞增生李斯特氏菌在靠近金黄色葡萄球菌的接种端溶血增强，李斯特氏菌

溶血也增强，而伊氏李斯特氏菌在靠近马红球菌的接种端溶血增强。
5.6 小鼠毒力试验（可选择）
将符合上述特性的纯培养物接种于TSB-YE 中，于30℃±1℃ 培养24h , 4000 r/min 离心5 min , 弃上清液，用无菌生理盐水制备成浓度为10 CFU/mL 的菌悬液，取此菌悬液进行小鼠腹腔注射3 只～5 只，每只0.5mL ，观察小鼠死亡情况。致病株于2d-5d 内死亡。试验时可用已知菌做对照。单核细胞增生李斯特氏菌、伊氏李斯特氏菌对小鼠有致病性。
5.7 结果报告
综合以上生化试验和溶血试验的结果，报告25g （或25mL ）样品中检出或未检出单核细胞增生李斯特氏菌。
第二法全自动酶联荧光免疫分析仪筛选法
6 原理
mini VIDAS 或VIDAS 单核细胞增生李斯特氏菌分析，是在自动VIDAS 仪器上进行的双抗体夹心酶联荧光免疫分析方法。固相容器（SPR ）用抗单核细胞增生李斯特氏菌抗体包被，各种试剂均封闭在试剂条内。煮沸过的增菌肉汤加人试条孔后，在特定时间内样本中的单核细胞增生李斯特氏菌抗原与包被在SPR 内部的单核细胞增生李斯特氏菌抗体结合，未结合的其他成分通过洗涤步骤清除。标记有碱性磷酸酶的抗体与固定在SPR 壁上的单核细胞增生李斯特氏菌抗原结合，最后洗去未结合的抗体标记物。SPR 中所用荧光底物为磷酸4-甲基伞型物。结合在SPR 壁上的酶将催化底物转变成具有荧光的产物：4-甲基伞形酮。VIDAS 光扫描器在波长450 nm 处检测该荧光强度。试验完成后由VIDAS 自动分析结果，得出检测值，并打印出每份样本的检测结果。
7 设备和材料
mini VIDAS 或VIDAS 。
8 试剂
8.1 LMO2 试剂条。
8.2 校正液：纯化灭活的单核细胞增生李斯特氏菌抗原标准溶液。
8.3 阳性对照。
8.4 阴性对照。
8.5 MLE 卡。
9 操作步骤
9.1 前增菌
以无菌操作取样品25g（或25mL ）加人到含有225mL Demi- Fraser 肉汤的均质袋中，在拍击式均质器上连续均质1 min-2 min ；或放入盛有225mL Demi- Fraser 肉汤的均质杯中，8000r/min-1000or/min 均质1 min-2 min 。于300C±l℃ 培养24h 。同时做阳性及阴性对照。
9.2 增菌与处理
取1mL 前增菌液接种于10mL Fraser 肉汤，于30℃±1℃ 培养24h ，取1mL 增菌液加人试管中，100℃ 水浴15min 。剩余增菌液保存于2℃ ～5℃ ，以备对阳性检测结果进行确认。
9.3 上机操作
9.3.1 输入MLE 卡信息
每个试剂盒在使用之前，首先要用试剂盒中的MLE 卡向仪器输人试剂规格（或曲线数据）。每盒试剂只需输入一次。
9.3.2 校正
在输人MLE 卡信息后，使用试剂盒内的校正液进行校正，校正必须做双份测试。以后每14 天进行一次校正。
9.3.3 检测
取出试剂条，待恢复至室温后进行样本编号。
建立work list ，输人样本编号。
分别吸取500 μL 对照和样本（冷却至室温）加人到试剂条样本孔中央。依屏幕提示，将试剂条放人仪器相应的位置。
所有分析过程均由仪器自动完成，检测约需45 min 。
9.4 结果报告
9.4.1 检测值（X ）是样品的相对荧光值（RFVI ）与标准溶液的相对荧光值（RFV : ）的比值，见式（1 ）。
X=RFV1/RFV2? …………（1 )
若检测值＜0.05 ，则检测结果为阴性；检测值≥0.05 ，则检测结果为阳性。
9.4.2 检测结果阴性，可直接报告25g（或25mL ）样品中未检出单核细胞增生李斯特氏菌。检测结果阳性的样品，应按照5.2-5.4 对保存于2℃-5℃ 的增菌液进行确认并报告。

第三法全自动病原菌检测系统筛选法

10 原理
BAX 系统或BAX 系统Q7 利用多聚酶链反应（PCR ）来扩增并检测细菌DNA 中特异片段来判断目标菌是否存在。反应所需的引物、DNA 聚合酶和核昔酸等被合并成为一个稳定、干燥的片剂，并装人PCR 管中，检测系统运用荧光检测来分析PCR 产物。每个PCR 试剂片都包含有荧光染料，该染料能结合双链DNA ，并且受光激发后发出荧光信号。在检测过程中，BAX 系统通过测量荧光信号的变化，分析测量数据，从而判定阳性或阴性结果。
11 设备和材料
11.1 系统主机及工作站。
11.2 加热槽。
11.3 冷却槽。
12 试剂
12.1 BAX 单核细胞增生李斯特氏菌检测试剂盒
12.1.1 裂解缓冲液。
12.1.2 蛋白酶。
12.1.3 带药片的PCR 管。
12.1.4 透明盖。
12.2 溶菌试剂
12.3 李斯特氏菌缓冲增菌肉汤（buffered Listeria enrichment broth,BLEB )
见第A.12 章。
12.4 丙磺酸钠-李斯特氏菌缓冲增菌肉汤（MOPS-buffered Listeria enrichment broth , MOPS-BLEB ) 见第A.13 章。
12.5 半量FRASER 肉汤（demi-Fraser )
见第A.14 章。
12.6 uvM 李斯特氏菌增菌肉汤（UVM Listeria Enrichment Broth , UVM-LEB )
见第A ．巧章。
12.7 李斯特氏菌增菌肉汤（Listeria enrichment broth , LEB )
见第A.16 章。
13 操作步骤
13.1 增菌
13.1.1 生肉：称取25g样品于225mL demi-Fraser 肉汤中，均质后，30℃±l℃ 培养22h-24h ；移取100 拌L 转种于9.9mL MOPSBLEB 中，36℃±l℃ 培养18h-24h 。
13.1.2 熟肉制品：称取25g样品于225mLUVM-LEB 中，均质后，300℃±l℃ 培养22h-24h ；移取100μL转种于9.9mL MOP-BLEB 中，36℃±1℃ 培养18h-24h 。
13.1.3 乳品：称取25g 样品于225mL LEB 中，均质后，在36℃±1℃ 培养22h-26h ；移取1mL 转种于9mLMOPS-BLEB 中，36℃±1℃ 培养18h-24h 。
13.1.4 熏鱼：称取25g 样品于225mL LB1中，均质后，36℃±1℃ 培养22h-26h ；移取1mL 转种于9mL MOPS-BLEB 中，36℃±1℃ 培养18h-24h 。
13.1.5 其他食品：称取25g （或25mL ）样品于225mL 不含抗生素的BLEB 中，均质后，在30℃±1℃ 培养4h ，然后加入抗生素在30℃±1℃ 培养20h ，移取10μL 转种于9.9mL MOPSBLEB 中，36℃±l℃ 培养18h-24h 。
13.2 上机操作
13.2.1 打开加热槽分别加热至55℃ 和95℃ ，检查冷藏过夜的冷却槽（4℃ ），开机并启动BAX 系统软件。如果仪器自检后建议校正，按屏幕提示进行校正操作。
13.2.2 创建“rack”文件：根据提示在完整的“rack”文件和“个样”资料中输人样品信息。
13.2.3 溶菌操作：在每个溶菌管加入200μL 配制好的溶菌试剂，取5μL 增菌肉汤加入相应的溶菌管中，盖上盖子。将溶菌管放在55℃ 加热槽中，加热60 min ；再将溶菌管转移到在95℃ 的加热槽中，加热10 min ；最后将溶菌管转移到冷却槽上（冷却槽从冰箱取出后30 min 内使用完毕），冷却5 min 。剩余增菌肉汤保存于2℃-8℃ ，以备对阳性检测结果确认。
13.2.4 加热循环仪／检测仪：从菜单中选择“RUN FULL PR0CESS，加热到设定温度（加热槽90℃ ，盖子l000℃ ）。
13.2.5 溶菌产物转移：将PCR 管支架放到专用冷却槽上，然后将带药片的PCR 管放人到支架内。将所有的管盖放松并除去一排管盖。用多道加样器将50μL 溶菌产物加人此排管中，并用替代的透明盖密封PCR 管。换用新吸头，重复上述操作，直至将所有样品转人带药片的PCR 管中。
13.2.6 扩增和检测：按“PCR Wizard”的屏幕提示，将加完样的PCR 管放人PCR 仪／检测仪中开始扩增。全过程（扩增和检测）需要大约3.5h 。当检测完成后，" PCR Wizard ”提示取出样品，并自动显示结果。
13.3 结果报告
绿色“-”表示阴性结果。
红色“+”表示阳性结果。

李斯特氏菌检验设备和试剂

李斯特氏菌检验程序图