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创伤弧菌检验标准操作程序



录入时间:2020-3-25 15:44:24 来源:2020年国家食品污染和有害因素风险监测工作手册(下卷)-微生物方法SOP

1  方法来源

   FDA/BAM   Chapter 9   Vibrio2004


2  适用范围

   本程序规定了食品中创伤弧菌(Vibrio vulnificus)的检验方法。本程序适用于食品中创伤弧菌的检验。

 

3  设备和材料

   除微生物实验室常规灭菌及培养设备外,其他设备和材料如下。

3.1  恒温培养箱:36℃±1℃、39.5℃±0.5℃。

3.2  冰箱:2℃~5℃、7℃~10℃。

3.3  恒温水浴箱:36℃±1℃。

3.4  均质器或无菌乳钵。

3.5  天平:感量0.1 g。

3.6  无菌试管:18 mm×180mm、15mm×100mm。

3.7  无菌吸管:1mL(具0.01mL刻度)、10mL(具0.1mL刻度)或微量移液器及吸头。

3.8  无菌锥形瓶:容量250mL、500 mL、1000mL。

3.9  无菌培养皿:直径90mm。

3.10  无菌手术剪、镊子。

3.11  PCR仪。

3.12  电泳装置。

3.13  凝胶分析成像系统。

3.14  PCR超净工作台。

3.15  高速台式离心机(15000r/min)。

3.16  微量可调移液器(2μL、10μL、100μL、1000μL)和相应吸头。


4  培养基和试剂

4.1  3%氯化钠碱性蛋白胨水:见附录A中A.1。

4.2  改良纤维二糖-多粘菌素B-多粘菌素E(mCPC)琼脂:见附录A中A.2。

4.3  纤维二糖-多粘菌素E(CC)琼脂:见附录A中A.3。

4.4  3%氯化钠胰蛋白胨大豆琼脂:见附录A中A.4。

4.5  3%氯化钠三糖铁琼脂:见附录A中A.5。

4.6  嗜盐性试验培养基:见附录A中A.6。

4.7  3%氯化钠赖氨酸脱羧酶试验培养基:见附录A中A.7。

4.8  3%氯化钠MR-VP培养基:见附录A中A.8。

4.9  3%氯化钠溶液:见附录A中A.9。

4.10 氧化酶试剂:见附录A中A.10。

4.11 革兰氏染色液:见附录A中A.11。

4.12 邻硝基酚-β-D-半乳糖苷(ONPG)试剂:见附录A中A.12。

4.13 Voges-Proskauer(V-P)试剂:见附录A中A.13。

4.14 生化鉴定试剂盒。

4.15 DNA提取液。

4.16 6×上样缓冲液。

4.17 0.5×TBE。

4.18 琼脂糖。

4.19 DNA分子量标记物(100 bp-1000 bp)。

4.20 PCR反应配套试剂。


第一法 定性检验

5  检验程序

创伤弧菌检验程序见图1。

6  操作步骤  

6.1  样品制备

6.1.1 非冷冻样品采集后应立即置7℃~10℃冰箱保存,尽可能及早检验;冷冻样品应在45 ℃以下不超过15min或在2 ℃~5 ℃不超过18 h解冻。

6.1.2 鱼类和头足类动物取表面组织、肠或鳃。贝类取全部内容物,包括贝肉和体液;甲壳类取整个动物,或者动物的中心部分,包括肠和鳃。如为带壳贝类或甲壳类,则应先在自来水中洗刷外壳并甩干表面水分,然后以无菌操作打开外壳,按上述要求取相应部分。

6.1.3 以无菌操作取样品25g(mL),加入3%氯化钠碱性蛋白胨水225mL,用旋转刀片式均质器以8000r/min~10000r/min均质1min~2min,或拍击式均质器拍击1min~2min,制备成1:10的样品匀液。如无均质器,则将样品放入无菌乳钵,自225mL3%氯化钠碱性蛋白胨水中取少量稀释液加入无菌乳钵,样品磨碎后放入500mL无菌锥形瓶,再用少量稀释液冲洗乳钵中的残留样品1~2次,洗液放入锥形瓶,最后将剩余稀释液全部放入锥形瓶,充分振荡,制备1:10的样品匀液。

6.2  增菌

将上述1:10样品匀液于36℃±1℃培养18 h~24 h。

6.3  分离

6.3.1 对所有显示生长的增菌液,用接种环在距离液面以下1cm内沾取一环增菌液,于mCPC或CC平板上划线分离。于39℃~40 ℃过夜培养(如果达不到39 ℃~40 ℃,则35 ℃~37 ℃)。

6.3.2 典型的创伤弧菌在mCPC和CC平板上呈现为圆的、扁平的、中心不透明边缘透明的黄色菌落,直径1 mm~2 mm。

6.4  纯培养

挑取3个或以上可疑菌落,划线接种3%氯化钠胰蛋白胨大豆琼脂平板,36℃±1℃培养18 h~24 h。

6.5  初步鉴定

6.5.1 氧化酶试验:挑选纯培养的单个菌落进行氧化酶试验,创伤弧菌为氧化酶阳性。

6.5.2 涂片镜检:将可疑菌落涂片,进行革兰氏染色,镜检观察形态。创伤弧菌为革兰氏阴性,呈棒状、弧状、卵圆状等多形态,无芽胞,有鞭毛。

6.5.3 挑取纯培养的单个可疑菌落,转种3%氯化钠三糖铁琼脂斜面并穿刺底层,36℃±1℃培养24 h观察结果。创伤弧菌在3%氯化钠三糖铁琼脂中的反应为底层变黄不变黑,无气泡,斜面颜色不变或红色加深,偶尔斜面变黄。

6.5.4 嗜盐性试验:挑取纯培养的单个可疑菌落,分别接种0%、6%、8%和10%不同氯化钠浓度的胰胨水,36℃±1 ℃培养24 h,观察液体混浊情况。创伤弧菌在无氯化钠、8%氯化钠和10%氯化钠的胰胨水中不生长或微弱生长,在6%氯化钠的胰胨水中生长旺盛。

6.6  确证鉴定

取纯培养物分别接种含3%氯化钠的赖氨酸脱羧酶试验培养基、MR-VP培养基,36℃±1℃培养24 h~48 h后观察结果;3%氯化钠三糖铁琼脂隔夜培养物进行ONPG试验。可选择生化鉴定试剂盒。创伤弧菌的生化性状见表1,创伤弧菌主要性状与其他弧菌的鉴别见表2。

表1   创伤弧菌的生化性状

试验项目

结果

革兰氏染色镜检

阴性,棒状或弧状

氧化酶

动力

D-纤维二糖

蔗糖

葡萄糖

分解葡萄糖产气

乳糖

硫化氢

赖氨酸脱羧酶

V-P

ONPG

注:+阳性;-阴性。

 

表2   创伤弧菌主要性状与其他弧菌的鉴别

名称

V

P

42

D

D

D

ONPG

嗜盐性试验

NaCl含量(%)

0

3

6

8

10

创伤弧菌
V. vulnificus















V







副溶血性弧菌

V. parahaemolyticus



















V













V































溶藻弧菌

V. alginolyticus





















霍乱弧菌

V.cholerae








V














拟态弧菌

V.mimicus





















河弧菌

V. fluvialis









V












V


弗氏弧菌

V.furnissii





















梅氏弧菌

V. metschnikovii









V












V


霍利斯弧菌

V. hollisae









nd













嗜水气单胞菌

A.hydrophilia



V






V


V



V


V


V









类志贺邻单胞菌
P. shigelloides

注:nd 表示未试验;V 表示可变。

6.7   PCR鉴定(选做)

6.7.1  DNA模板的制备

     取可疑的纯菌落加入500 μL灭菌dH2O中混匀煮沸10 min,15000×g离心3 min。取上清液储存在-20℃直至使用。也可以用商业化的DNA提取试剂盒并按其说明提取制备DNA模板。

6.7.2  PCR扩增

6.7.2.1 引物

Vvh-785F

5' ccg cgg tac agg ttg gcg ca 3'

Vvh-1303R

5' cgc cac cca ctt tcg ggc c 3'

           扩增片段长度:519 bp

6.7.2.2 阴性对照、阳性对照设置

     阴性对照(空白对照)以灭菌水作为PCR反应的模板;

     阳性对照采用含有检测序列的DNA(或质粒)作为PCR反应的模板。

6.7.2.3 PCR反应体系

试剂

反应体积

dH2O

28.2 μL

10× Buffer. MgCl2

5.0 μL

dNTPs

8.0 μL

引物

7.5 μL

模板

1.0 μL

Taq酶

0.3 μL

总体积

50.0 μL

 

6.7.2.4 PCR反应程序


预变性

94℃

10 min;

变性

94℃

1 min,

退火

62℃

1 min,

延伸

72℃

1 min,25个循环;

终延伸

72℃

10 min;

保存

8℃

——


6.7.2.5 电泳

用0.5×TBE制备1.5%的琼脂糖凝胶(含EB或Goldview0.5μg /mL,)。各取5 μl PCR产物点样(可包括适量上样缓冲液),用DNA分子量标记物做参照,电压100 V,电泳50 min(根据实验室仪器情况确定具体电泳条件)。使用凝胶成像系统对电泳结果进行保存和分析。

6.8  结果判定

阴性对照未出现条带,阳性对照出现预期大小的扩增条带条件下,如待测样品未出现519 bp大小的扩增条带,则可判定该样品检验结果为阴性;如待测样品出现519 bp大小的扩增条带,则可判定该样品检验结果为阳性。

如果阴性对照出现条带和/或阳性对照未出现预期大小的扩增条带,本次待测样品的结果无效,应重新进行试验,并排除污染因素。

6.9 报告

根据生化或PCR结果,报告25 g(mL)样品中检出或未检出创伤弧菌。


第二法 MPN计数法


7  操作步骤

7.1  样品制备

   同6.1。

7.2  增菌

7.2.1 用灭菌吸管吸取1:10样品匀液1 mL,注入含有9 mL 3%氯化钠碱性蛋白胨水的试管内,振摇试管混匀,制备1:100的样品匀液。

7.2.2 另取1 mL灭菌吸管,按6.2.2.1操作程序,依次制备10倍系列稀释样品匀液,每递增稀释一次,换用一支1 mL无菌吸管。

7.2.3 根据对检样污染情况的估计,选择3个适宜的连续稀释度,每个稀释度接种3支含有9mL3%氯化钠碱性蛋白胨水的试管,每管接种1mL。置36℃±1℃恒温箱内,培养18 h~24 h。

7.3 分离鉴定

   同定性检测。


结果与报告

  根据证实为创伤弧菌阳性的试管管数,查最可能数(MPN)检索表,报告每g(mL)创伤弧菌的MPN值。

 

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