显微镜观察方法

（一）光学显微镜下观察法

   1.插片法 适用于观察放线菌的自然生长状态

   在适合菌种生长的固体培养基上，涂布接种观察的菌株，然后用摄子把灭过菌的盖玻片以45°角插入平板中，然后置适宜的生长温度培养（一般一个平板可插6～8片）。 在不同生长期取出盖玻片，用结晶紫染lmin、水洗、干燥，在光学显微镜下观察，摄像。

   2.盖片法

   用适合菌种生长的固体培养基倒平板，涂布接种上需观察的菌株，然后用无菌小刀在平板正中间切去1cm左右的琼脂块，用镊子夹一块无菌载玻片盖于有沟的琼脂平板上，置适当温度下培养。菌株会沿玻片生长。生长好后取出载玻片，结晶紫染色1 min、水洗、干燥。在光学显微镜下观察到生长完整的气生菌丝体，同时摄影。

（二）透射电子显微镜观察法

   1.材料

   透射电镜一台，载样铜网膜，火棉胶。

   2.方法

   （1）火棉胶准备：2g火棉胶溶于100 ml醋酸异戊酣中。

   （2）载样膜的制备：先把铜网膜用浓硫酸浸漂2min,再用水洗数次，最后将洗净的铜网膜铺在有滤纸的培养皿中。轻轻注入无菌水，取配好的火棉胶液滴一滴在水面上，由于火棉胶在水面上的表面张力形成一薄膜，将第一、二次的膜除掉，薄膜形成后迅速用吸管在培养皿的边缘处吸去水分，直至吸干，使膜紧紧贴在铜网上为止，室温干燥备用。

   （3）点样：用生长丰茂的菌株制成菌悬液，用毛细管吸取菌液并滴在铜网上。也可以用贴印法，即用制好的铜网在有气生菌丝体的菌块上轻轻印一下，然后，在光学显微镜下先检查一下网是否完整，及荫是否贴上或分布均匀。然后喷碳或投影（通常用于细菌鞭毛观察），便可在透射电子显微镜下观察或摄影。

（三）扫描电镜观察法

   扫描电镜可以观察到菌体表面的立体形象，它通过三维形象逼真地反映出样品表面结构的凹凸不平，如细菌的形态、鞭毛结构、放线菌孢子的表面装饰物等都以立体状反映出来。

   1.材料

   扫描电镜一台，临界点干燥器，白金粉，戊二醛，乙醇。

   2.方法

   菌株培养于适宜生长的平板培养基上-待生长好后用小刀切成0.5～0.7cm3的方块一然后小刀削薄→置瓷染色盆中→立即加2.5％戊二醒固定1.5h→吸去戊二醛→分别加30%、50%、70%、90%、100％乙醇各脱水15min→取出放于圆形容器中→临界点干燥1h→取出贴于一圆形铜片上→白金溅射喷锁，厚度约2～5mm→置扫描电镜下观察及摄影。

   本文节选自《常见细菌系统鉴定手册》第十二章。

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