有机酸测定

1.挥发性有机酸

  （1）标准溶液配制：（国产分析纯）

   将上述溶液分别置于100 ml容量瓶中，加水至刻度，为1 mol/L标准母液，取母液稀释100倍为10 mmol/L。

  （2）样品预处理（酸化）：准备取1 ml的幼龄(24 h) PYG培养液， 以50%H₂S0₄,调pH至2，混匀，8000r/min离心1 min，同时有标准样品混合物和空白PYG培养液同时酸化。

  （3）气相色谱测定：用10 μl微量注射器取上述离心的上清液2μl用气相色谱分析

   仪器型号：日本岛津公司GC-TAG型气相色谱仪C-R3A型自动积分记录仪。

   检测器：FID

   色谱柱：3mm X lm不锈钢柱

   色谱柱填料：GDX-401(60-80目）载气及流速：高纯氮50 ml/min

   氢气压力：0.6 kg/cm2

   空气压力：0.5 kg/cm2

   色谱柱温度：220℃

   检测器温度：300℃

   记录纸速：3mm/min

  （4）结果判断：将待检菌株的测定结果与标准溶液结果比较，根据各组分峰的保留时间以决定各峰的组分，并根据各组分峰的积分面积计算其浓度，参阅VPI厌氧菌实验室手册分析标准菌株图谱进一步识别。

2.非挥发性有机酸

  （1）标准溶液配制：

   将上述溶液移入同一个100ml容量瓶中，加少许蒸馏水待溶解后，再吸取丙酮酸0.72ml,乳酸1.35 ml置于上述的容量瓶中，再加蒸馏水至刻度。乳酸，草酸，丙二酸，丙酮酸，骁珀酸的浓度分别为0.1 mol/L，反丁烯二酸的浓度为0.05 mol/L。在进行气相色谱分析时要像培养物一样进行甲酯化。

  （2）样品甲酯化①吸取1 ml培养液于5 ml比色管中；②加入0.4 ml50% H₂S0₄和2ml无水甲醇，盖塞混匀，放60℃水浴30 min或室温过夜；③测定前加入1 ml蒸馏水和0.5 ml氯仿，混匀，3000r/min,离心5 min。

  （3）气相色谱测定：用10 μl微量注射器取管底氯仿层2μl进样分析。

   仪器型号：日本岛津公司GC-TAG型气相色谱仪C-R3A型自动积分记录仪。

   检测器：FID

   色谱柱：3mm X 2m不锈钢柱

   色谱柱填料：GDX-401(60-80目）载气及流速：高纯氮30 ml/min

   氢气压力：0.6 kg/cm2空气压力：0.5kg/cm2色谱柱温度：150'C检测器温度：250℃记录纸速：3 mm/min

  （4）结果判断；同挥发性有机酸。

   附：如果无气相色谱仪的条件，测定有否乳酸，可用纸层析方法， 方法如下：

   乳酸测定

  (1)培养基：本试验可结合测定乳酸细菌从葡萄糖产酸产气试验进行。 使用的培养基同前（见糖醇类发酵试验）。将被测定的菌接种于液体培养基中，30℃培养3～5天，如果产酸，再做纸层析。

  (2)纸层析法：①展开剂：水：苯甲醇：正丁醇以1:5:5的量相混合，然后加1％的甲酸。②显色剂：0.04％的溴酚蓝乙醇溶液，用O.lN的NaOH调pH到6.7。

  采用国产新华滤纸或Whatman一号滤纸，依据样品的多少，选择一大小合适的滤纸，在纸张下方距边约3cm处划条横线，每隔2.5-3 cm划一点作为点样位置，并注明点样编号。在点样的同时需要用2％的乳酸和不接种培养液二个样品用为对照。

   将纸放入层析缸先用展开剂饱和已点样的滤纸过夜，然后加展开剂开始层析。一般上行25cm即可。取出諒干后喷显色剂，观察样品上行是否出现有黄色斑点，并与对照比较其产生黄点的位置，以确定是否乳酸。

   本文节选自《常见细菌系统鉴定手册》第十四章。

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