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有机酸测定



录入时间:2020-5-14 11:03:29 来源:青岛海博生物

1.挥发性有机酸

 

  (1)标准溶液配制:(国产分析纯)

乙酸

5.78ml

丙酸

7.5ml

异丁酸

9.37ml

丁酸

9.28ml

异戊酸

11.15ml

戊酸

10.97ml

已酸

12.12ml

   将上述溶液分别置于100 ml容量瓶中,加水至刻度,为1 mol/L标准母液,取母液稀释100倍为10 mmol/L。

  (2)样品预处理(酸化):准备取1 ml的幼龄(24 h) PYG培养液, 以50%H2S04,调pH至2,混匀,8000r/min离心1 min,同时有标准样品混合物和空白PYG培养液同时酸化。

  (3)气相色谱测定:用10 µl微量注射器取上述离心的上清液2µl用气相色谱分析

   仪器型号:日本岛津公司GC-TAG型气相色谱仪C-R3A型自动积分记录仪。

   检测器:FID

   色谱柱:3mm X lm不锈钢柱

   色谱柱填料:GDX-401(60-80目)载气及流速:高纯氮50 ml/min

   氢气压力:0.6 kg/cm2

   空气压力:0.5 kg/cm2

   色谱柱温度:220℃

   检测器温度:300℃

   记录纸速:3mm/min

  (4)结果判断:将待检菌株的测定结果与标准溶液结果比较,根据各组分峰的保留时间以决定各峰的组分,并根据各组分峰的积分面积计算其浓度,参阅VPI厌氧菌实验室手册分析标准菌株图谱进一步识别。

 

2.非挥发性有机酸

 

  (1)标准溶液配制:

琥珀酸

1.1789g

丙二酸

1.04g

草酸

1.234g

反丁烯二酸

0.582g

   将上述溶液移入同一个100ml容量瓶中,加少许蒸馏水待溶解后,再吸取丙酮酸0.72ml,乳酸1.35 ml置于上述的容量瓶中,再加蒸馏水至刻度。乳酸,草酸,丙二酸,丙酮酸,骁珀酸的浓度分别为0.1 mol/L,反丁烯二酸的浓度为0.05 mol/L。在进行气相色谱分析时要像培养物一样进行甲酯化。

  (2)样品甲酯化①吸取1 ml培养液于5 ml比色管中;②加入0.4 ml50% H2S04和2ml无水甲醇,盖塞混匀,放60℃水浴30 min或室温过夜;③测定前加入1 ml蒸馏水和0.5 ml氯仿,混匀,3000r/min,离心5 min。

  (3)气相色谱测定:用10 µl微量注射器取管底氯仿层2µl进样分析。

   仪器型号:日本岛津公司GC-TAG型气相色谱仪C-R3A型自动积分记录仪。

   检测器:FID

   色谱柱:3mm X 2m不锈钢柱

   色谱柱填料:GDX-401(60-80目)载气及流速:高纯氮30 ml/min

   氢气压力:0.6 kg/cm2空气压力:0.5kg/cm2色谱柱温度:150'C检测器温度:250℃记录纸速:3 mm/min

  (4)结果判断;同挥发性有机酸。

   附:如果无气相色谱仪的条件,测定有否乳酸,可用纸层析方法, 方法如下:

   乳酸测定

  (1)培养基:本试验可结合测定乳酸细菌从葡萄糖产酸产气试验进行。 使用的培养基同前(见糖醇类发酵试验)。将被测定的菌接种于液体培养基中,30℃培养3~5天,如果产酸,再做纸层析。

  (2)纸层析法:①展开剂:水:苯甲醇:正丁醇以1:5:5的量相混合,然后加1%的甲酸。②显色剂:0.04%的溴酚蓝乙醇溶液,用O.lN的NaOH调pH到6.7。

  采用国产新华滤纸或Whatman一号滤纸,依据样品的多少,选择一大小合适的滤纸,在纸张下方距边约3cm处划条横线,每隔2.5-3 cm划一点作为点样位置,并注明点样编号。在点样的同时需要用2%的乳酸和不接种培养液二个样品用为对照。

   将纸放入层析缸先用展开剂饱和已点样的滤纸过夜,然后加展开剂开始层析。一般上行25cm即可。取出諒干后喷显色剂,观察样品上行是否出现有黄色斑点,并与对照比较其产生黄点的位置,以确定是否乳酸。

   本文节选自《常见细菌系统鉴定手册》第十四章。

 

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