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细胞壁的化学组成分析法



录入时间:2020-5-14 11:24:32 来源:青岛海博生物

1.全细胞分析法(薄层层析法)

 

  (1)材料:①微晶纤维(Cellulose microcrystalline);②层析缸:21cm x 6cm;③普通玻璃板:20cm X 5 cm;④标准氨基酸,糖。

  (2)方法:

   1)制板:把玻璃板洗净,取微晶纤维每g加蒸馏水3.5ml(置三角瓶中)调成均匀糊状;在玻璃板上涂成薄层,每个板约微晶纤维1.2-1.5 g,风干,不需要活化,即可使用 。

   2)用菌株生长的液体培养基,分装于20 cm X 2 cm试管中,每管8ml。灭菌后接种并在摇床培养3~5天后,过滤培养液,用蒸馏水冲洗菌体两次,再用无水乙醇冲洗两次。取经上述处理过的混菌体30mg装于硬质玻璃管内(0.9 cm X 12 cm),用于氨基酸分析,另取30mg用于糖组份分析。

   3)菌体水解;在做氨基酸分析的玻璃管中放入6N HCl 0.1ml。在做糖分析的玻璃管中加入0.5N HCl 0.1ml,火焰封口,放入烘箱, 温度上升120℃后,再持续15 min取出。用于氨基酸分析的水解液以黑褐色为宜,用于糖分析的水解液以黄棕色为宜。

   4)点样:用微量进样器抽取0.4μl氨基酸水解液点在薄板距下缘1 cm处,并点0.01 mol D,L-DAP,同时点含有L,L-DAP, meso-DAP和D-DAP的 标准氨基酸混合液,以及天门冬氨酸,甘氨酸,谷氨酸,丙氨酸0.2 µl标准样。取另一薄板,以相同方法点含有1%鼠李糖,核糖,木糖,阿拉伯糖,甘露糖,葡萄糖和半乳糖的混合液0.2µ1作为标准样。

   5)展层剂:氨基酸分析:甲醇:吡啶:冰乙酸:水(10:1:0.25:5);糖分析:乙酸乙酷:吡啶:冰乙酸(8:5:1.5)。

   6)展层:点好的薄板直接放入层析缸中,不需要饱和,层析时间约3h。

   7)显色:氨基酸分析:用0.4%莉三酮(水饱和正丁醇);糖分析:用苯胺,邻苯二甲酸。

   以上分别喷显色剂显色:置100-110℃,2-5min,显出颜色。核糖、木糖和阿拉伯糖显色后呈粉红色,其他糖呈褐黄色。

 

2.纯细胞分析(薄层层析法)

 

  (1)材料:同全细胞分析法。

  (2)方法:

   1)制板:同全细胞分析法

   2)菌体收集:取10 g对数后期湿菌体(不得用于菌体或开始自溶的菌体,也不要在室温下保存的菌体,如需保存应把菌体保存在冰冻状态下),悬浮于30-40ml,0.1 mol/L pH8.0磷酸缓冲液中,用超声波破菌体,菌体破碎后,先用3000r/min离心3 min除去未破碎的菌体,上清液再以15000-16000 r/min离心,得到破碎的细胞壁。当菌体的全细胞糖型为A(含半乳糖和阿拉伯糖)的菌较难破碎也较难沉淀,可适当延长破碎和离心时间。这样得到的细胞壁沉淀物用pH 8.0的磷酸缓冲液,95%的乙醇分别清洗二次,然后在2%的乙醇KOH溶液(2 g KOH溶于100 ml 95%乙醇中)中皂化(37℃振荡2~3天),再用95%乙醇,蒸馏水分别清洗二次,再用过滤过的含胰蛋白酶的pHS.O磷酸缓冲液(缓冲液中含胰蛋酶3 mg/ml)处理粗制细胞壁(37℃振荡2h),用pH S.O磷酸缓液,蒸馏水各清洗二次,清洗后的沉淀物再用胃蛋白酶的盐酸溶液(3 mg/ ml 0.02N HCI)处理(37℃振荡过夜)。然后再0.02N HCI、蒸馏水、乙醇分别清洗2次,最后用氯仿清洗一次,得纯细胞壁。

   3)菌体水解:同全细胞分析法

   4)点样:同全细胞分析法

   5)展层法:氨基酸分析:甲醇:吡啶:冰乙酸:水(10:0.5:0.125:2.5);糖分析:同细胞壁分析法。

   6)显色剂及显色:同全细胞分析。

  本文节选自《常见细菌系统鉴定手册》第十四章。

 

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