细胞壁的化学组成分析法

1.全细胞分析法（薄层层析法）

  （1）材料：①微晶纤维(Cellulose microcrystalline)；②层析缸：21cm x 6cm；③普通玻璃板：20cm X 5 cm；④标准氨基酸，糖。

  （2）方法：

   1）制板：把玻璃板洗净，取微晶纤维每g加蒸馏水3.5ml（置三角瓶中）调成均匀糊状；在玻璃板上涂成薄层，每个板约微晶纤维1.2-1.5 g,风干，不需要活化，即可使用 。

   2）用菌株生长的液体培养基，分装于20 cm X 2 cm试管中，每管8ml。灭菌后接种并在摇床培养3～5天后，过滤培养液，用蒸馏水冲洗菌体两次，再用无水乙醇冲洗两次。取经上述处理过的混菌体30mg装于硬质玻璃管内(0.9 cm X 12 cm)，用于氨基酸分析，另取30mg用于糖组份分析。

   3）菌体水解；在做氨基酸分析的玻璃管中放入6N HCl 0.1ml。在做糖分析的玻璃管中加入0.5N HCl 0.1ml,火焰封口，放入烘箱， 温度上升120℃后，再持续15 min取出。用于氨基酸分析的水解液以黑褐色为宜，用于糖分析的水解液以黄棕色为宜。

   4）点样：用微量进样器抽取0.4μl氨基酸水解液点在薄板距下缘1 cm处，并点0.01 mol D,L-DAP,同时点含有L,L-DAP, meso-DAP和D-DAP的 标准氨基酸混合液，以及天门冬氨酸，甘氨酸，谷氨酸，丙氨酸0.2 μl标准样。取另一薄板，以相同方法点含有1％鼠李糖，核糖，木糖，阿拉伯糖，甘露糖，葡萄糖和半乳糖的混合液0.2μ1作为标准样。

   5）展层剂：氨基酸分析：甲醇：吡啶：冰乙酸：水(10:1:0.25:5)；糖分析：乙酸乙酷：吡啶：冰乙酸（8:5:1.5）。

   6）展层：点好的薄板直接放入层析缸中，不需要饱和，层析时间约3h。

   7）显色：氨基酸分析：用0.4％莉三酮（水饱和正丁醇）；糖分析：用苯胺，邻苯二甲酸。

   以上分别喷显色剂显色：置100-110℃，2-5min,显出颜色。核糖、木糖和阿拉伯糖显色后呈粉红色，其他糖呈褐黄色。

2.纯细胞分析（薄层层析法）

  （1）材料：同全细胞分析法。

  （2）方法：

   1)制板：同全细胞分析法

   2）菌体收集：取10 g对数后期湿菌体（不得用于菌体或开始自溶的菌体，也不要在室温下保存的菌体，如需保存应把菌体保存在冰冻状态下），悬浮于30-40ml,0.1 mol/L pH8.0磷酸缓冲液中，用超声波破菌体，菌体破碎后，先用3000r/min离心3 min除去未破碎的菌体，上清液再以15000-16000 r/min离心，得到破碎的细胞壁。当菌体的全细胞糖型为A（含半乳糖和阿拉伯糖）的菌较难破碎也较难沉淀，可适当延长破碎和离心时间。这样得到的细胞壁沉淀物用pH 8.0的磷酸缓冲液，95％的乙醇分别清洗二次，然后在2％的乙醇KOH溶液(2 g KOH溶于100 ml 95％乙醇中）中皂化(37℃振荡2～3天），再用95％乙醇，蒸馏水分别清洗二次，再用过滤过的含胰蛋白酶的pHS.O磷酸缓冲液（缓冲液中含胰蛋酶3 mg/ml)处理粗制细胞壁(37℃振荡2h)，用pH S.O磷酸缓液，蒸馏水各清洗二次，清洗后的沉淀物再用胃蛋白酶的盐酸溶液(3 mg/ ml 0.02N HCI)处理(37℃振荡过夜）。然后再0.02N HCI、蒸馏水、乙醇分别清洗2次，最后用氯仿清洗一次，得纯细胞壁。

   3）菌体水解：同全细胞分析法

   4）点样：同全细胞分析法

   5）展层法：氨基酸分析：甲醇：吡啶：冰乙酸：水（10:0.5:0.125:2.5）；糖分析：同细胞壁分析法。

   6)显色剂及显色：同全细胞分析。

  本文节选自《常见细菌系统鉴定手册》第十四章。

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