DNA的G+C含量测定

(一)熔解温度(Tm)法

1.菌株培养和收集

  （1）固体平板法：以菌悬液接种千平皿或克氏瓶的琼脂培养基上，培养基和培养条件选其菌最合适的。一般24h（生长慢的菌可延长；芽孢菌应缩短，控制在生孢之前）后，用0.15 mol/LNaCl与0.1 mol/LEDTA (pH8.0)缓冲液洗平板，收集菌体。

  （2）液体摇瓶法：接种斜面种子于装有液体培养基的三角瓶内，置200 r/min的摇床培养16-24h后离心。以上述同样的缓冲液洗细胞，最终溶于同样的缓冲液中，浓度为2～3g湿细胞125 ml缓冲液。

2.DNA提取和纯化

  （1）将上述培养液或细胞悬液离心收集细胞，并以TE缓冲液(10mmol/LTris-HCI；1m mol/LEDTA, pH8.0)洗细胞，悬浮于50m mol/LTris-HCI—5 m mol/L EDTA (pH 8.0)缓冲液中。

  （2）加溶菌酶0.5-1 mg/ml（终浓度），置37℃水浴摇床30-60 min。

  （3）加SDS(20%）至终浓度2%, 60℃水浴10 min或更长。

  （4）加5 mol/LNaCI04至终浓度为1 mol/L。

  （5）加等体积氯仿－异戊醇(24:1 v/v)，振荡10 min。

  （6）离心5000 r /min, 10 min。

  （7）吸取含DNA的上清水层，加2倍体积乙醇(95%）。

  （8）用玻璃棒卷出DNA丝。

  （9）溶于0.1 SSC (0.1 SSC: 0.015 mol/LNaCl-0.0015 mol/L柠檬酸钠）。

  （10）重复5～9步骤2～3次，视样品含蛋白质量而定。

  （11）加终浓度为50 μg/ml的RNA酶，（RNA酶在0.15 mol/LNaCl (pH 5.0)中80摄氏度预处理10 min,以除DNA酶）置37℃水浴摇床30 min。

  （12）加等体积氯仿－异戊醇摇10 min。

  （13）离心5000 r/min, 5 min。

  （14）吸取水相，加2倍体积乙醇(95%）。

  （15）用玻璃棒卷出DNA丝。

  （16）重复12-15直至无蛋白层。

  （17）加1 ml 3mol/LNaAC-0.001 mol/L EDTA pH 7.0。

  （18）边搅边加0.54倍体积的异丙醇。

  （19）溶于O.lSSC。DNA纯度检查：O.D值230:260:280=0.454中0.515

3.Tm测定

  （1）仪器：带加温装置的紫外分光光度计。

  （2）步骤：①心波长固定于260 nm；②将待测样品用O.lSSC稀释至OD260值于0.3～0.6间；③在波长260 nm首先记录25℃飞的吸光度(A25 )然后温度迅速上升至50℃；④每隔3～5℃记录一次；⑤OD值开始上升表示变性开始，每隔l℃稳定5 min,记录杯内温度和OD值，直至OD值不变表示变性完毕。

4.Tm值计算

  （1）热变性温度测定完成后，将记录的温度和相应光密度整理成表。

  （2）含各光密度乘相应温度的相对膨胀系数(Vt)与25℃时光密度相比Vt/V25,求得相对的光密度。

  （3）以温度为横坐标，以相对光密度为纵坐标，绘制热变性曲线。热变性曲线中点相对应的温度即为熔链温度(Tm值）。

5.G+C mol％含量计算

  0.1SSC:G+Cmol% =2.44Tm-69.3

  1SSC:G+Cmol% =2.08Tm-106.4

  注：必须以大肠埃希氏菌(E.coli K₁₂)为参比操作对照，以核实实验误差。

（二）浮力密度法

  在氯化铯(CsCI)中DNA的浮力密度（ρ）与它的G+C含量呈线性增长关系。当DNA分子在CsCl溶液中高速离心时，会在CsCl密度梯度形成的一定部位形成DNA带。这个带的DNA分子密度相当于这个部位的CsCl的密度，这个带中点的DNA密度称作为它的浮力密度(ρ)。

  称固体CsCl 6.3 g溶于合适的缓冲液(0.05mol/LTris-HCl pH 7.3)调整到最终重置为10g,即密度约1.700 g/cm 3,分别使1 ml C-sCl缓冲液含2-3 μgDNA和相同量 的标准DNA,重新调密度到1.700 g/cm 3,并用折射仪作简单核算：1.700密度相当于折光指数1.3994。将溶液倒入10mm的单个分段杯放入离心机转头， 然后于分析超速离心机中逐渐加速至45,000 r/min, 25℃离心20h。利用DNA对紫外吸收来确定未知DNA密度带的位置和标准DNA密度带的位置，求得它们与离心机中心的距离(r和r0)。

  利用公式：

  ρ= ρ_o + 0. 0092 (r²-r²₀），ρ0为标准DNA密度(E.coli的ρ_o为1.710 g/cm3 )。根据Schildkraut公式， 求出待测DNA的G+C含量：

  ρ= 1.66 + 0.098 (G+ C)

  本文节选自《常见细菌系统鉴定手册》第十五章。

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