DNA/DNA（杂交）同源性测定

(一)菌体收集和DNA提取

  同“DNA的G+C含量测定”部分。

(二)DNA/DNA同源性测定方法

  现介绍应用较多的两种:

  1.复性率方法:

   (1)DNA样品处理：用溶菌酶或SDS等破壁提取的DNA丝状溶解物，实验前需先置冰浴中用超声波50 W超声4次，每次15 s,间隔1-2min,使DNA片段在2～5 x 105dalton;用超声破壁提取的DNA溶液,不再做超声处理。

   (2)DNA变性：将剪切过的待测DNA样品(A、B)分别用O.lSSC精确配制成OD260为1.5或2.0（约50 μg/0D)；取样品A、B各3 ml分别装在两支中试管里，再取A,B各1.5ml装在同一支试管中混匀为样品M。A、B、M三个样品测试前分别置沸水浴中变性10 min,用预热的1 ml吸管吸预热的lOSSC O72 ml加入上述变性样品中，稍加混匀,使最终浓度为2SSC。

   (3)测定DNA的复性速率：①开机和选择测量条件，打开分光光度计，待仪器校正后，选择时间扫描，固定260 nm波长，选择3 mm/min的扫描 速度自动控制时间，并使记录纸上的量程放大2-2.5倍。②预热比色架和比色杯（装有2SSC)。用半导体点温计通过热敏电阻探头监视杯中溶液的温度，使其稳定在指定的最适复性温度（TOR）。③上样：待达到TOR后，弃去比色杯中的2SSC溶液，迅速转入变性DNA样品液，同时接通热敏电阻，观察温度。全部过程不得使样品的温度低千TOR。④测定复性率：待测试样品的温度达到TOR时，开始记录相应的吸光度，以此为零时，随后每隔5 min读数一次，待反应进行到30 min时，停止扫描。最终得到一条随时间延长、吸光值逐渐减小的直线。⑤计算复性速率：用零时的吸光度减去30 min时的吸光度，除以总时间(30 min)，得出直线的斜率， 即DNA的复性速率（通常用V表示单位为每分钟吸光值的减少值）。 每个样品需重复测试2～3次。计算：
   0min～30min的吸收值/30min=V（复性率）

   4Vm-（Va-Vb）/2√VaVb X 100

   Va、Vb和Vm分别表示A、B样品和M为混合样品的复性速率。

  2.固相分子杂交方法

   （1）制膜：取0.2 mlDNA溶液（含量约为10 μg/0D)，加入蒸熘水至2.5 ml,于lOO℃变性10 min,转入冰浴，加入预冷的12 X SSC 2.5 ml,减压慢速滤过微孔膜(GSWP,孔径0.22 μm,膜径为25 mm,用前在蒸馏水和6XSSC中分别浸泡半小时），再以25 ml 6 x SSC抽滤洗膜（收集DNA的滤液，测其OD₂₆₀,与滤前相比较，可求得吸附率），滤膜于室温过夜，然后以不锈钢打孔器刻得6 mm直径的小膜，于80℃烘干4 h,最后放入真空干燥器内，4℃保存备用。

   （2）标记：取100 μg变性DNA溶液于0.1 mol/LNaAc-0.04 mol/LHAc (pH 5.0)溶液中，置冰浴，并依次加入KI (2.5 m mol/L水溶液），使终浓度为0.25 m mol/L；加Na125I 200-400 μCi混合，最后加入三氯化驼（6.5 X 10-2mol/LTiCl3水溶液），使其终浓度为6.5 X 10-3mol/L。总的反应体积为0.3-0.ml。混合物在60℃水浴中保温20 min,冷却加入新配制的0.1 mol/L NH₄Ac-0.5 mol/LN比OH调pH至8.7, 60℃保温20 min,冷却。上Sephadex G50柱(32 x 1.5 cm)，以重蒸馏水洗脱，并收集6～7管(2-3 ml／管）。每管取IOμl滴于小滤纸片，干燥，投入盛5 ml液闪液[0.4% 2, 5－二苯恶唑，0.01%1, 4－双（苯基恶唑基-2)－苯的甲苯液］的测量瓶内，以NE 8312液闪测量仪测量放射性强度，同时用紫外分光光度计测量每管的OD260。其中皆高者为己标上¹²⁵I的DNA溶液，置冰箱保存备用。

   （3）杂交：将6张载有变性DNA的小膜和1张对照的空白小膜一同置于瓶（直径3 cm,高4.5 cm)内，加入2 ml Denhardt预温液(3XSSC中含有0.02％菲可，0.02%聚乙烯吡咯烷酮和0.02％牛血清白蛋白）， 加塞置37℃处理5 min,然后吸出预温液。加入经4号针头(2 ml针管）反复压挤剪切15-20次的125I-DNA液，含标记DNA约3 μg，加入12SSC和2% SDS,使总反应体积约1 ml。 反应液的SSC的终浓度为2XSSC, SDS的浓度为0.1%。 塞紧塞子，置60℃水浴中反应15h,吸出反应液，用2XSSC在60℃下洗膜3次，干燥小膜，加5 ml液闪液，置液闪仪测置其放射性。

   （4）同源性百分数计算：以参考菌株标记的DNA与自身未标记的DNA杂交膜（简称同源膜）所测得脉冲数减去空白膜脉冲数，与参考菌株标记的DNA和测定菌株未标记的DNA杂交膜（简称异源膜）脉冲数也减去空白膜的脉冲数，然后二者相比，得出参考菌株和测定菌株之间的同源性分数。如公式所示：
   同源性%=(异源膜脉冲数-对照膜脉冲数)/(同源膜脉冲数-对照脉冲数) X100

   本文节选自《常见细菌系统鉴定手册》第十五章。

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