随机扩增DNA多态性分析

  随机扩增DNA多态性分析(Random Amplified Polymorphic DNA, RAPD)又称为随意引物PCR(Arbitrary Primed PCR, AP-PCR)是一种DNA指纹多态性分析技术，其理论依据是不同的基因组中与随意引物匹配的碱基序列的位点和数目可能不同，因而用一组人设计的核昔酸作为引物，通过PCR随机扩增可产生物种 特异性的DNA带谱。因此RAPD技术可用于细菌种间、亚种间乃至株间的亲缘关系分析，未知菌株的快速鉴定和流行病学调查等。此外，RAPD的PCR产物还可作为探针，与Southern杂交技术结合，用于基因组或菌落杂交，可以填补基因组的遗传图谱和物理图谱间的空缺。

  RAPD技术是1990年Williams和Welsh两个实验室分别建立的，Williams将通常PCR扩增中使用的特定序列引物巧妙地改为单一的仅由10个碱基的随机序列引物；而Welsh则使用几组通用引物，通过设置PCR扩增参数也达到了产生物种 特异性的DNA指纹图。他们的研究赋予了RAPD显著的优点：在对基因组序列一无所知的前提下即可分析其DNA的多态性；方法的简单快捷和高度重复性可普及应用。

(一)方法一

  1.细菌基因组DNA制备

  以葡萄球菌(Staphylococcus)为例。菌株在2～5 ml的心脑浸液培养基中培养过夜，收集细胞并溶于0.2 ml的TE缓冲液；加入0.2 mg/ml的金葡溶菌酶,在37t保温lh;加入0.2 ml蛋白酶K溶液（0.5mg/ml蛋白酶K,1% SOS,200 m mol/L EDTA,1 mmol/L CaCl2)，50℃保温lh;澄清的上清用酚、氯仿抽提后用乙醇沉淀DNA;将DNA溶于TE中，并在琼脂糖凝胶上电泳测定终浓度。

  2.PCR扩增引物

  引物I: Kpn-R: CCAAGTCGACATGGCACARTGTATACATAYGTAAC

  引物II: pBs: GGA.GGAAACAGCfATGACCATGA

  3.AP-PCR

  初级反应体系10μl: 0.025UTaqDNA聚合酶，Taq缓冲液(strata-gene)含4 mmol/LMgCh, 0.2 mmol/L各个dNTP,10 μ mol/LKpn-R引物或PBS引物，和DNA模板（浓度：30 pg-7.5 ng)。首先进行两个低强度PCR循环：94℃, 5min; 40℃, 5 min; 72℃,5 min; 10高强度PCR循环：94℃,1 min; 60℃,1 min; 72℃,2 min;加入二级反应体系：2.25UTaq, Taq缓冲液，0.2 mmol/L各个dNTP和50μ Ciα- [32P] dCTP，继续进行20-30个高强度PCR循环。

  4.聚丙烯酰氨凝胶电泳分离AP-PCR产物和放射自显影

  PCR产物在5％的聚丙烯酰氨凝胶上电泳分离，1kb的标准分子量DNA作为对照，TBE作为电泳缓冲液。用Kodak XAR-5胶片进行放射自显影。

(二)方法二

  1.DNA的纯化

  同上

  2.引物设计

  引物设计遵照如下原则：①长度为9～10核甘酸；②G+C mol％范围50- 80,③无回文结构。如：随机引物0995: 5'CCGAGTCCA3';或随机引物5'TGGTCAC'TGA3'。

  3.PCR扩增

  25 μl的反应体系：10 mmol/LTris-HCI (pHS.3); 50 mmol/LKCI;2mmol/LMgCl2; 0.01％明胶；100 μmol/L dATP, dCTP, dGTP, dTIP; 0.2μmol/L引物；25ng基因组DNA; 0.5UTaq聚合酶。

    94℃, 1 min; 36℃, 1 min; 72℃, 2 min。

  4.PCR产物

  在1.4％琼脂糖凝胶上电泳分离。

（三）影响AP-PCR的因素

  (1) PCR的退火温度可能影响AP PCR带谱的特异性和重复性，但其影响程度取决于引物的长度，引物长时影响不大可使用高退火温度；引物短时影响大因而退火温度要低 以保证引物与模板的结合。

  (2)模板浓度：DNA的模板浓度以30pg-7.5ng为适宜，lOpg是低限。

  (3)引物选择：AP-PCR的引物不需特异选择，尤其当用于种的鉴定时。但不同序列的引物扩增的PCR多态性不同，尤其是种或株特异性的DNA片段。

  本文节选自《常见细菌系统鉴定手册》第十五章。

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