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2020药典《1101无菌检查法》学习笔记之1101无菌检查法



录入时间:2020-6-24 16:32:00 来源:微信公众号蒲公英

  无菌检查法系……未发现微生物污染。

  无菌检查应在无菌条件下进行,试验环境必须达到无菌检查的要求,检验全过程应严格逄守无菌操作,防止微生物污染,防止污染的措施不得影响供试品中微生物的检出。单向流空气区域、工作台面及受控环境应定期按医药工业洁净室(区)悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法的现行国家标准进行洁净度确认。隔离系统应定期按相关的要求进行验证,其内部环境的洁净度须符合无菌检查的要求。日常检验需对试验环境进行监测

 

  学习:“应在无菌条件下进行”,这句话此版药典仍是如此表述,没有实力改造的情况下,C+A级送风环境应该还能再次维持一个药典周期吧。“受控”两个字为新增,对于检验洁净环境,受控主要的关注指标应该是悬浮粒子、浮游菌和沉降菌,当然其它如压差、温湿度等的指标和监测频度也应满足9205《药品洁净实验室微生物监测和控制指导原则》的要求。

 

  培养基

  ……(未变化,略)。

  培养基的制备及培养条件

  培养基可按以下处方制备,亦可使用按该处方生产的符合规定的脱水培养基或商品化的预制培养基。配制后应采用验证合格的灭菌程序灭菌。制备好的培养基若不即时使用,应置于无菌密闭容器中,在2~25℃、避光的环境下保存,并在经验证的保存期内使用。

 

  学习:由原来的的“成品培养基”调整为“商品化的预制培养基”,更易于理解。应注意最后标红的调整内容。不再强调“非密闭-三周”、“密闭-一年”的规定,便于实践掌握并防止浪费,更适合国情;当然,你最好有一个稳健的验证过程和结果,以支持你的封闭条件和保存周期。

 

  1.硫乙酵酸盐流体培养基

  ……葡萄糖/无水葡萄糖5.5g/5.0g刃天青溶液1. 0ml…………分装至适宜的容器中,其装量与容器高度的比例应符合培养结束后培养基氧化层(粉红色)不超过培养基深度的1/2。灭菌。在供试品接种前,培养基氧化层的高度不得超过培养基深度的1/3 ,否则……

 

  学习:配方中允许使用葡萄糖。配制灭菌后的培养基使用前质量检查,氧化层由原来的“1/5”调整为现在的“1/3”,虽然现在看似标准变松了,但确实更符合检验实践,也更容易判断。

 

  2.~7.……(省略)

  8.马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)

 

  学习:新增一种培养基,用于菌液制备中“黑曲”的增菌培养。对于培养基,尤其是干粉培养基,你真的需要核对标签上的处方,避免与药典的差异。

 

  培养基的适用性检查

  无菌性检查:无菌检查用的……或与供试品的无菌检查同时进行。

  无菌性检查每批培养基一般随机取不少于5支(瓶),置各培养基规定的温度培养14天,应无菌生长。

 

  学习:应考虑实践中用于无菌性检查培养的试管装灭菌培养基与无菌检验用的三角瓶装培养基在灭菌方法验证时的两种包装的温度、F0等结果。否则,也不要在乎那几瓶了。这里的支/瓶,应该分别对应管法和膜法。

 

  菌种:培养基灵敏度检查所用的菌株传代次数不得超过5代(从菌种保存中心获得的干燥菌种为第0代),并采用适宜的菌种保藏技术进行保存和确认,以保证试验菌株的生物学特性。

  ……(CMCC一堆数字,略)

 

  学习:这个“确认”在15版药典时,放在了9203《药品微生物实验室质量管理指导原则》中,要求“标准贮备菌株应进行纯度和特性确认。……必要时,实验室应对工作菌株的特性和纯度进行确认。”也就是说,菌种的确认不在作为指导原则存在,而应该落实在文件、实践中了。已知菌种确认的方法有菌落形态观察描述/拍照、生化检定/生化试剂盒、DNA……

 

  菌液制备

  接种金葡、铜绿、枯草的新鲜培养物至胰酪大豆陈液体培养基中或胰酪大豆陈琼脂培养基上,接种生抱梭菌的新鲜培养物至硫乙醇酸盐流体培养基中,30~35℃培养18~24小时;接种白念的新鲜培养物至沙氏葡萄糖液体培养基中或沙氏葡萄糖琼脂培养基上,20~25℃培养2~3天,上述培养物用pH7. 0无菌氯化钠-蛋白脉缓冲液或0. 9%无菌氯化钠溶液制成适宜浓度菌悬液。接种黑曲霉至沙氏葡萄糖琼脂斜面培养基或马铃薯葡萄糖琼脂培养基上,20~25℃培养5~7天或直到获得丰富的孢子,加入适量含0. 05%(ml/ml)聚山梨酯80的……。然后,采用适宜的方法吸出抱子悬液至无菌试管内,用……制成适宜浓度的孢子悬液。

 

  学习:白念的培养时间由24~48小时调整为2~3天;终于白念可以长得很好了,菌悬液不再强制要求100cfu/ml以下(下文取用量也调整为不大于100cfu/ml);洗黑曲孢子的聚山梨酯80的溶液不再强制3~5ml,应根据孢子的喷落量灵活调整。

  一个图简介菌种类型


 

  菌悬液若在室温下放置,一般应在2小时内使用……在验证过的贮存期内使用。

  培养基接种:取适宜装量的硫乙醇酸盐流体培养基7支,分别接种不大于l00cfu的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、生抱梭菌各2支,另1支不接种作为空白对照;取适宜装量的胰酪大豆陈液体培养基7支,分别接种不大于100cfu的枯草芽抱杆菌、白色念珠菌、黑曲霉各2支,另1支不接种作为空白对照。接种细菌的培养管培养时间不超过3天,接种真菌的培养管培养时间不得超过5天。逐日观察结果。

 

  学习:确实,真菌培养时间要稍微长一些,其它的3天之内生长很好了,时间长了反而污染环境或者造成其他实验室危害。这样改操作性更强了。修订专性需氧菌的培养基用量,不再强制要求9ml。删除“逐日观察结果”(不仅此处,无菌检查的样品观察也同步修改了,见后文)。

 

  结果判定:空白对照管应无菌生长……检查符合规定。

  稀释液、冲洗液及其制备方法

  稀释液、冲洗液配制后应采用验证合格的灭菌程序灭菌。

  1.……必要时滤过使澄清……。

  2.……必要时滤过使澄清……。

  根据供试品的特性……加入表面活性剂或中和剂等。

  方法适用性试验

  进行产品无菌检查时,应进行方法适用性试验,以确认所采用的方法适合于该产品的无菌检查。若检验程序或产品发生变化可能影响检验结果时,应重新进行方法适用性试验。

 

  学习:这里“检验程序”应结合9203《药品微生物实验室质量管理指导原则》和1101仔细思考。

 

  方法适用性试验按……进行方法确认。

  菌种及菌液制备

  金葡、枯草、生孢、白念、黑曲霉的菌株及菌液制备同培养基灵敏度检查。大肠埃希菌的菌液制备同金黄色葡萄球菌。

 

  学习:大肠埃希菌未参与培养基灵敏度检查,在1101中,只参与方法适用性。

 

  薄膜过滤法:按供试品的无菌检查要求,取每种培养基规定接种的供试品总量,采用薄膜过滤法过滤,冲洗,在最后一次的冲洗液中加入不大于100cfu的试验菌,过滤。加培养基至滤筒内, 接种金葡、大肠、生孢的滤筒内加硫乙醇酸盐流体培养基;接种枯草、白念、黑曲霉的滤筒内加胰酪大豆脉液体培养基。另取一装有同体积培养基的容器,加入等量试验菌,作为对照。置规定温度培养,培养时间不得超过5天。

 

  学习:哪种菌加入哪种培养基内明确出来,防止错误,利于方法学实践。

 

  直接接种法:取符合直接接种法培养基用量要求的硫乙醇酸盐流体培养基6管,分别接人不大于100cfu的金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、生抱梭菌各2管;取符合直接接种法培养基用黛要求的胰酪大豆脉液体培养基6管,分别接人不大于100cfu的枯草芽抱杆菌、白色念珠菌、黑曲霖各2管。其中1管按供试品的无菌检查要求,接入每支培养基规定的供试品接种最,另1管作为对照,置规定的温度培养,培养时间不得超过5天。

  结果判断:与对照管比较……并重新进行方法适用性试验。

  方法适用性试验也可与供试品的无菌检查同时进行。 

  供试品的无菌检查

  无菌检查法包括薄膜过滤法和直接接种法。只要供试品性质允许,应采用薄膜过滤法。供试品无菌检查所采用的检查方法和检验条件应与方法适用性试验确认的方法相同。

 

  学习:考验方法学确认的设计和检验SOP的设计是否能够紧密联系。

 

  无菌试验过程中,若需使用表面活性剂、灭活剂、中和剂等试剂,应证明其有效性,且对微生物无毒性。

  检验数量:检验数量……不包括阳性对照试验的供试品用量。

  检验量:是指供试品每个最小包装接种至每份培养基的最小量(g或ml)……若每支(瓶)供试品的装量按规定足够……全部过滤。

 

  学习:这里注意“装量”,装量不是规格量,这个指标要在方法学阶段结合理化的测试结果考虑。这也是“检验程序”的一部分,若装量有改变,方法学就要考虑考虑了。“表3”有调整,见后文。

 

  阳性对照 应根据……加菌量不大于100cfu ,供试品用量同供试品无菌检查时每份培养基接种的样品量。阳性对照管培养不超过5天, 应生长良好。

 

  学习:阳性对照的培养时间由72小时内,调整为“不超过5天”。考虑特殊情况下阳性菌生长慢的情况。建议较好设计批检验记录,减少无谓劳动量。

 

  阴性对照:供试品……不得有菌生长。

  供试品处理及接种培养基

  操作时,……内容物。

  除另有规定外……接种培养基。

  1.薄膜过滤法

  薄膜过滤法一般应采用封闭式薄膜过滤器,根据供试品及其溶剂的特性选择滤膜材质。无菌检查用的滤膜孔径应不大于0.45μm。滤膜直径约为50mm,若使用其他尺寸的滤膜,应对稀释液和冲洗液体积进行调整,并重新验证。使用时,应保证滤膜在过滤前后的完整性。

水溶性供试液过滤前,一般应先将少量的冲洗液过滤……若需要用冲洗液冲洗滤膜,每张滤膜每次冲洗量一般为100ml,总冲洗量一般不超过500ml,最高不得超过1000ml,以避免滤膜上的微生物受损伤。

 

  学习:2020版药典在此节的第一段行文顺序进行了调整。红色部分为增加内容。注意“总冲洗量一般不超过500ml”的规定。

 

  水溶性液体供试品 取规定量……。

  水溶性固体和半固体供试品 取规定量……。

 

  学习:“半固体供试品”为新增样品类型。

 

  可溶于十四烷酸异丙酯的膏剂和黏性油剂供试品:取规定量,混合至适量的无菌十四烷酸异丙酯中(无菌十四烷酸异丙酯的制备可采用薄膜过滤法过滤除菌,选用孔径为0. 22μm的适宜滤膜,或其他适宜的灭菌方法),……或将各容器置— 20°C或其他适宜温度冷冻约1小时,取出,迅速消毒供试品开启部位或阀门,正置容器,用无菌钢锥或针样设备以无菌操作迅速在与容器阀门结构相匹配的适宜位置钻一小孔,……。

  装有药物的注射器供试品……。

  具有导管的医疗器械(输血、输液袋等)供试品:除另有规定外,取规定最,每个最小包装用适量的(通常50~100ml)冲洗液分别冲洗内壁,收集冲洗液于无菌容器中,然后照水溶性液体供试品项下方法操作。同时应采用适宜的方法对包装中所配带的针头等要求无菌的部件进行无菌检查。

 

  学习:增加了“除另有规定外”,有单独批准的情况应照相应正文执行。本节最后一句进行了调整,表述更准确。

 

  2.直接接种法

   ……

  混悬液等非澄清水溶性液体供试品、固体供试品、非水溶性供试品、敷料供试品、肠线、缝合线等供试品……。

  灭菌医用器械供试品 除另有规定外,取规定量……。

 

  学习:增加了“除另有规定外”,有单独批准的情况应照相应正文执行。

 

  放射性药品……。

  培养及观察

  将上述接种供试品后的培养基容器分别按各培养基规定的温度培养不少于14天;接种生物制品的硫乙醇酸盐流体培养基的容器应分成两等份,一份置30~35°C培养,一份置20~25℃培养。培养期间应定期观察并记录是否有菌生长。如在加入供试品后或在培养过程中,培养基出现浑浊,培养14天后,不能从外观上判断有无微生物生长,可取该培养液不少于1ml转种至同种新鲜培养基中,将原始培养物和新接种的培养基继续培养不少于4天,观察接种的同种新鲜培养基是否再出现浑浊;或取培养液涂片,染色,镜检,判断是否有菌。

 

  :取消了“逐日观察”的规定,那问题是,隔几天观察一次呢…… 规定了疑似培养液的最少转种量,并且原始培养物和新接种的培养基继续培养不少于4天(原来规定新转种培养不少于3天)。 “培养基出现浑浊,培养14天后”,作为时间操作,转种或者直接镜检检定,你更倾向于哪种呢?

 

  增加了一天,意味着检验周期应调整文14+4天。

  结果判断

  若供试品管均澄清,或虽显浑浊但经确证无菌生长,判供试品符合规定;若供试品管中任何一管显浑浊并确证有菌生长,判供试品不符合规定,除非能充分证明试验结果无效,即生长的微生物非供试品所含。只有符合下列至少一个条件时方可认为试验无效:

  (1)无菌检查试验所用的设备及环境的微生物监控结果不符合无菌检查法的要求。

  (2)回顾无菌试验过程,发现有可能引起微生物污染的因素。

  (3)在阴性对照中观察到微生物生长。

  (4)供试品管中生长的微生物经鉴定后,确证是因无菌试验中所使用的物品和(或)无菌操作技术不当引起的。 试验若经评估确认无效后,应重试。重试时,重新取同量供试品,依法检查,若无菌生长,判供试品符合规定;若有菌生长,判供试品不符合规定。

 

  学习:原15版中此节“阳性对照管应生长良好”删除,“在阴性对照中观察到微生物生长”放在后文“试验无效”的子集中。更具条理性。“重试时,重新取同量供试品”,注意理解,这不同于OOS的扩大调查。

 

  表1批出厂产品及生物制品的原液和半成品最少检验数量

  ……主表未变。

 

  注:若供试品每个容器内的装量不够接种两种培养基,那么表中的最少检验数量应增加相应倍数。

  学习:这个“附注”需要结合表3使用,同时注意“阳性对照”也需要同样增加的问题。

 

  表2上市抽验样品的最少检验数量

  ……

  表3供试品的最少检验量

 

  注意:表3中,对于固体制剂,供试品装量在50mg≤M<300mg的范围时,“每支供试品接入每种培养基的最少量”为:半量,但不得少于50mg。

  本文转载自微信公众号蒲公英。

 

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