电子显微镜样品的制备

  一、目的要求
学习并掌握制备微生物及核酸电镜样品的基本方法．
二、电子显微镜与光学显微镜的主要区别
显微镜的分辨率取决于所用光的波长．1933 年开始出现的电子显微镜正是由于使用了彼长比可见光短得多的电子束作为光源，使其所能达到的分辨率较光学显微镜大大提高。而光翻的不同，也决定了电子显微镜与光学显微镜的一系列差异 
根据电子束作用于样品的方式的不同及成像原理的差异，现代电子显微镜已发展形成了许多种类型，目前最常用的是透射电子显微镜和扫描电子显微镜，前者总放大倍数可在1000~ 1000000 估范围内变化，后者总放大倍数可在20~3 000000 倍之间变化．本实验主要介绍这两种显微镜样品的制备．
三、器材
1 菌种大肠杆菌（大肠埃希氏菌）斜面．
2 ．溶液或试剂醋酸戊脂，浓硫酸，无水乙醇，无菌水，2 ％磷钨酸钠（pH6 . 5 一8.0 ）水冷液，。3 ％聚乙烯甲醛溶液，细胞色素c ，醋酸铁，质粒PBR322 . 
3 ．仪器或其他用具普通光学显微镜，铜网，瓷漏斗，烧杯，平皿，无菌滴管，无菌镊子．大头针，载玻片，细菌计数板，真空镀膜机，临界点干燥仪等
四、操作步骤
（一）透射电镜的样品制备及观察
1 ．金属网的处理
光学显微镜的样品是放置在载玻片上进行观察，而在透射电镜中，由于电子不能穿透玻璃，只能采用网状材料作为载物．通常称为载网．载网因材料及形状的不同可分为多种不同的规格，其中最常用的是2 阳～400 目（孔数）的钊网。网在使用前要处理，除去其上的污物，否则会影响支持膜的质量及标本照片的清晰度。本实验选用的是400 目的铜网，可用如下方法进行处理：首先用醋酸戊酷授漂几小时，再用蒸馏水冲洗数次，然后再将铜网浸漂在无水乙醇中进行脱水。如果铜网经以上方法处理仍不干净时，可用稀释的浓硫酸（l : l ）浸1~2 min ，或在1%NaOH 溶液中煮沸数分钟．用蒸馏水冲洗数次后，放人无水乙醇中脱水，待用．
2 ．支持膜的制备
在进行样品观察时，在载网上还应覆盖一层无结构、均匀的薄膜．否则细小的样品会从载网的孔中漏出去，这层薄膜通常称为支持膜或载膜．支持膜应对电子透明，其厚度一般应低于20nm ；在电子束的冲击下，该膜还应有一定的机械强度，能保持结构的稳定，并拥有良好的导热性；此外，支待网在电镜下应无可见的结构，且不与承载的样品发生化学反应，不干扰对样品的观察，其厚度一般为15nm左右．支持膜可用塑料膜｛如火棉胶膜、聚乙烯甲醛膜等），也可以用碳膜或者金属膜（如锹膜等） ．常规工作条件下，用塑料膜就可以达到要求，而塑料膜中火棉胶膜的制备相对容易．但强度不如聚乙烯甲醛膜．
( l ）火棉胶膜的制备在一干净容器〔 烧杯、平皿或下带止水夹的瓷漏斗）中放人一定量的无菌水，用无菌滴管吸2 ％火棉胶醋酸戊醋溶液，滴一滴于水面中央，勿振动，待醋酸戊酪蒸发，火膜胶则由于水的张力随即在水面上形成一层薄膜．用镊了将它除掉，再重复一次此操作，主要是为了清除水面上的杂质．然后适量滴一滴火棉胶液于水面，火棉胶液滴加量的多少与形成膜的厚薄有关，待膜形成后检查膜是否有皱折，如有，则除去一直待膜制好．
( 2 ）聚乙烯甲醛膜的制备
① 洗下净的玻璃板插人0.3％formvar 溶液中静置片刻（时间视所要求的膜的厚度而定），然后取出稍稍晾干使会在玻确板上便形成一层薄膜；
② 用锋利的刀片或针头将膜刻一矩形；
③ 将玻板轻轻斜插进盛满无菌水的容器中，借助水的表面张力作用使膜与玻片分离并漂浮在水面上．
3.转移支持膜到载网上，可有多种方法，常用的有如下二种：
〔 l ）将洗净的网放人瓷漏斗中，漏斗下套上乳胶管，用止水夹控制水流，缓缓向漏斗内加入无菌水，其量约高1cm ；用无菌镊子尖轻轻排除铜网上的气泡，并将其均匀地樱在漏斗中心区域；按2 所述方法在水面上制备支持膜，然后松开水夹，使膜缓缓下沉，紧紧贴在铜网上；将一清洁的滤纸筱盖在翻斗上防尘，自然干燥或红外线灯下烤干．千澡后的膜，用大头针尖在铜网周围划一下，用无菌摄子小心将铜网膜移到载玻片上，置光学显微镜下用低倍镜挑选完整无缺，厚薄均匀的铜网膜备用
( 2 ）按2 所述方法在平皿或烧杯里制备支持膜，成膜后将几片铜网放在膜上．再在上面放一张滤纸，浸透后用银于将滤纸反转提出水面．将有膜及铜网的一面朝上放在干净平皿中，置40 ℃ 烘箱使干燥．
4 ．制片
透射电镜样品的制备方法很多，如超薄切片法、复型法、冰冻蚀刻法、滴液法等，其中滴液法，或在滴液法基础上发展出来的其他类似方法如直接贴印法、喷雾法等主要被用于观察病毒粒子、细菌的形态及生物大分子等．而由于生物样品主要由碳‘氢、氧、氮等元素组成，散射电子的能力很低，在电镜下反差小，所以在进行电镜的生物样品制备时通常还须采用重金属盐染色或金属喷镀等方法来增加样品的反差，提高观察效果。例如负染色法就是用电子密度高，本身不显示结构且与样品几乎不反应的物质吃如瞬钨酸钠或磷钨酸钾）来对样品进行“染色，．由于这些重金属盐不被样品成分所吸附而是沉积到样品四周，如果样品具有表面结构，这种物质还能穿透进表面上凹陷的部分，因而在样品四周有染液沉积的地方，散射电子的能力强，表现为暗区，而在有样品的地方散射电子的能力弱，表现为亮区，这样便能把样品的外形与表面结构清楚地衬托出来．负染色法由于操作简单，目前在进行透射电镜生物样品制片时比较常用．本实验将主要介绍采用滴液法结合负染色技术观察细菌及核酸分子的形态．
五、实验报告
1 ．结果
描述你所制备的细菌和PBR322 质粒DNA 电镜制片在电子显傲镜下所观察到的形态特点．
2 思考题
( l ）利用透射电子显微镜来观察的样品为什么要放在以金属网作为支架的火棉膜（或其他膜）上？而扫描电子显微镜则可以将样品固定在盖玻片上？
（2）用负染色法制片时，磷钨酸钠或磷钨酸钾起什么作用？
 
   

 

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