非无菌药品微生物限度检查的影响因素分析

  在药品的生产、包装、运输、存储等环节中，一些外在的因素会造成微生物对药品的污染，进而对人体造成各种危害。非无菌药品微生物限度检查是对非灭菌制剂及其原料、辅料受微生物污染程度的一种检查方法。本文就该检查方法所受到的影响因素进行了分析，以期最大限度地保证检验结果的可靠性和准确性。

  药品是防病治病、保护人民健康的特殊商品。对非无菌药品，可允许该药品含有一定数量的活的微生物，但其含菌数量不能超过《中国药典》2015年版四部通则规定的非无菌药品微生物限度标准。

  在药品的生产、包装、运输、存储等环节中，由于空气、水、原辅料、包装材料、生产工艺、人员等因素，会存在非无菌药品中微生物或者微生物的代谢产物含量超标，而引起药品的污染、变质。通常，这些微生物包括细菌、霉菌、酵母菌，其中大量是与致病菌和产毒菌有关的菌属，如大肠杆菌、沙门菌、葡萄球菌、青霉、黄曲霉等。

  由于原辅料、生产工艺不同，不同类型的药品会被不同种类的微生物所污染。微生物种类越多，药品变质、失效的可能性越大，最终会对人体造成感染、发热、过敏、中毒等危害。非无菌药品微生物限度检查，是对非灭菌制剂及其原料、辅料受微生物污染程度的一种检查方法。对药品中微生物限度的检查，是评价生产企业的药用原料、辅料、设备、器具、工艺流程、生产环境和操作者卫生状况的重要手段和依据，也是控制和提高药品质量、保证人民群众安全用药的一项重要举措。目前，药品微生物限度的检查包括：中成药类、化学药品类、生化药品类的非规定灭菌制剂，药用原料及辅料，中药提取物及中药饮片。

  为了保证检测结果的真实、准确，在非无菌药品微生物限度的检查过程中，应注意以下四个方面的影响：（1）被污染药品中微生物的特殊性；（2）药品原污染状态的保持；（3）药品微生物限度检查方法的适用性试验；（4）检验人员素养的强化。

1.被污染药品中微生物的特殊性

1.1菌体易变性

  药品中菌体细胞的生长易受到外界环境的干扰，菌体细胞在药品中处于不稳定状态，它可随存放时间的延长而死亡，也可在适宜条件下增殖。因此，在适宜的标准化条件下，一定时间内药品的污染量才会处于动态平衡，才可以评估总体污染的状况。

1.2分布不均匀性

  除在生产前期的污染外，其它环节所造成的微生物污染都是局部的。因此，同批次产品中不同包装内的污染状态就会有差异，采取合理的抽样方法才能保证检验结果的代表性、准确性。

1.3菌体易受损

  由于微生物受到原料处理、加工等操作程序的影响，或者药品本身对微生物的抑杀作用，会使多数微生物处于受损坏状态。这些受到损坏的微生物用一般的方法检查，往往会出现假阴性或计数偏低的结果。

1.4受干扰因素复杂

  因为污染菌的来源多、种类多，而且药品种类多、剂型成分复杂，所以在不同的药剂中，测定同一种菌往往会得到不同的结果。

2.药品原污染状态的保持

  检验过程中保持检验药品的原污染状态，可使检验结果更加准确可靠。因而在检验过程中必须严格规范操作，以免药品二次污染，导致菌细胞再繁殖或死亡。

2.1检验环境的影响

  微生物限度检查应有单独的洁净实验室，洁净实验室应放在二层楼以上，远离污染源。每个洁净实验室应有独立的净化空气系统，其环境洁净度不应低于10000级，局部洁净度为100级。室内的温度应控制在l8～26oC， 相对湿度应控制在40%～60%。每次操作前后都要用0.1%苯扎溴铵溶液或其他适宜消毒液， 擦拭操作台及可能污染的死角，然后启动层流净化装置。缓冲间内应有洗手盆及无菌的实验服、帽、口罩、鞋套。操作台应备有天平、酒精灯、火柴、酒精棉球、助吸器等设备。

  检验用阳性菌操作应在独立的阳性菌实验室内进行， 不得与供试品检验共用同一个洁净实验室，避免交叉污染。

2.2检验材料及用具的影响

  用作酒精棉球的脱脂棉应在高压灭菌后再加入75%的酒精使用。培养基在使用前需做培养基适用性检查，且培养基和稀释液每次根据样品数量的多少配制。未使用完的新配培养基应在2～8oC避光冷藏条件下保存， 一般固体培养基保存不超过两周，液体培养基保存不超过四周，部分鉴定培养基保存不超过60d。培养基经灭菌后应进行预培养，以保证培养基的无菌度。

  操作过程中所用的器皿均应洗涤干净后用牛皮纸包扎严密灭菌。经高压蒸汽灭菌的物品取出时切勿立即置于冷处，避免因急速冷却，使灭菌物品内蒸汽冷凝造成负压易染菌，取出后应放置在恒温培养箱中烘干，待用。

  各种恒温恒湿培养箱除定期检定外，还应每天观察箱内温度及湿度波动的范围。高压蒸气灭菌器在每次使用时，应放入指示胶带或指示卡，利用其变色情况，判断是否在设定的温度与压力条件下达到灭菌效果。此外，对各种器械及设备均应有定期计量与检定记录，以保证正常使用。

3.药品微生物限度检查方法的适用性试验

  在药品微生物限度检查前，需对其检查方法的适用性进行验证。根据《中国药典》2015年版四部通则非无菌产品微生物限度检查方法（通1105、通则1106）[1]的要求，需对微生物计数方法适用性、控制菌检查法适用性进行验证。

3.1微生物计数方法适用性试验

  目前,平皿倾注法、薄膜过滤法及最可能数法是药品微生物计数的常用方法。平皿倾注法适用于抑菌作用弱或无抑菌功效的药品，是试验中最常用的方法，也是方法适用性试验的首选；薄膜过滤法适用于抑菌作用较强的药品；最可能数法因其精确度和准确度不及薄膜过滤法和平皿倾注法，更适用于某些受微生物污染量很小的供试品。在供试品的检查中，需要基于供试品的物理化学特性和微生物的限度标准，挑选操作简便、准确度高的方法，且应考虑供试品的抑菌性。另外，在培养基（或稀释液）灭菌前加入中和剂、灭活剂或表面活性剂，可用来消除干扰物抑菌的作用，避免损伤污染供试品的微生物。以上方法选择后，应对所选方法的适用性进行确认。

3.2控制菌检查法适用性试验

  控制菌检查法是在特定的环境下，对供试品中是否含有规定的致病性微生物进行检测。《中国药典》规定检查的控制菌有：耐胆盐革兰阴性菌、大肠埃希菌、沙门菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、梭菌、白色念珠菌。在常规法中，需在培养基中加入

  确定量的供试液和阳性试验菌（数量不大于100cfu）。对抑菌作用较强的药品，应采用薄膜过滤法。在具体的操作中，在集菌培养器中先过滤供试液，再利用冲洗液冲洗。在冲洗完毕后，向集菌培养器中加入阳性试验菌和规定的培养基。之后，在规定条件下进行微生物的培养和结果的判定。另外，应以稀释液替代供试液，按照前述方法同步进行阴性对照实验，以保证实验结果的准确性。

4.检验人员素养的强化

  检验人员在药品检验的过程中应始终牢记无菌观念。每次实验前，应对穿着的无菌服装进行高压灭菌处理，对工作环境使用紫外线照射30min，并使用消毒液擦拭超净工作台面。在操作完毕后，应对工作环境进行上述消毒、灭菌处理。

  综上，药品微生物限度检查工作是一项涉及知识面广，技术性高，影响因素多的工作。检查结果能否反映药品受微生物污染程度的真实性，除了本文所提到的诸多因素外，操作人员还必须掌握一定的微生物基本知识和熟练的无菌操作技术，严格按照《中国药典》2015年版四部中非无菌药品微生物限度检查法的规定进行操作，才能最大限度地保证检验结果的真实和准确，保障人民群众的安全用药。

  本文来自兰州药检所 刘荔等

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