鞭毛染色法及活细菌运动性的观察

一、目的要求
1 ．学习并初步掌握鞭毛染色法，观察细菌鞭毛的形态特征．
2 ，学习用压滴法和悬滴法观察细菌的运动性，
二、基本原理
鞭毛是细菌的运动“器官，细菌是否具有鞭毛，以及鞭毛者生的位里和数目是细茵的一项孟要形态特征．细菌的椒毛很纤细，其直径通常为0 . 01 ~0.02um ，所以，除了很少数能形成．毛束（由许多根鞭毛构成）的细菌可以用相差显微镜直接观察到鞭毛束的存在外，一般细菌的鞭毛均不能用光学显微镜直接观察到，而只能用电子显微镜观察．要用普通光学显微镜观寮细菌的鞭毛，必须用鞭毛染色法．
鞭毛染色的基本原理，是在染色前先用媒染剂处理，使它沉积在鞭毛上，使鞭毛直径加粗，然后再进行染色．鞭毛染色方法很多，本实验介绍硝酸银染色法和改良的Uifson 氏染色法，前一种方法更容易掌握．但染色剂配制后保存期较短．
在显微镜下观察细菌的运动性，也可以初步判断细菌是否有彼毛．细菌运动性的观察可用压清法和悬滴法。观察时，要适当减弱光强度以增加反差，若光线太强．细菌和周围的液体难以区分．
三、器材
1 ．菌种 苏云金芽孢杆菌，假单胞菌，金黄色花萄球菌．
2 ．染色剂 硝酸银鞭毛染色液，Leifson氏鞭毛染色液，0.01 ％美蓝水溶液．
3 ．仪器或其他用具 载玻片，盖玻片，凹载玻片，无菌水，凡士林，显微镜等．
四、操作步骤
（一）鞭毛染色
1 ．硝酸银染色法
( l ）菌种的准备要求用活跃生长期菌种作鞭毛染色和运动性的观察。对于冰箱保存的菌种，通常要连续移种1 一2 次，然后可选用下列方法接种培养作染色用菌种：a取新配制的营养琼脂斜面（表面较湿润、基部有冷凝水）接种，28 ? 32 ℃ 培养10~14h ，取斜面和冷凝水交接处培养物作染色观察材料；杠取新制备的营养琼脂（含0.8~ 1 . 0 ％的琼脂）平板，用接种环将新鲜菌种．点种丁平板中央，28 ~32 ℃ 培养18 ～30h ，让菌种扩散生长，取菌落边缘的菌苔（不要取菌落中央的菌谷）作染色观察的菌种材料．
( 2 ）载玻片的准备将载玻片在含适量洗衣粉的水中煮沸约20 例n ，取出用清水充分洗净，沥干水后置95 ％乙醇中，用时取出在火焰上烧去酒精及可能残留的油迹。
( 3 ）菌液的制备取斜面或平板菌种培养物数环于盛有1 一2 刘无菌水的试管中，制成轻度混浊的菌悬液用于制片．也可用培养物直接制片，但效果往往不如先制备菌液。挑菌时，尽可能不带培养基。
( 4 ）制片取一滴菌液于载玻片的一端，然后将玻片倾斜，便菌液缓缓流向另一端，用吸水纸吸去玻片下端多余菌液，室温｛或37 ℃ 温室）自然千燥．
干后应尽快染色不宜放，时间过长，
( 5 ）染色涂片干燥后，滴加硝酸银染色A 液顶盖3 一5 min ，用熏馏水充分洗去A 液．用B 液冲去残水后，冉加B 液夜盖涂片染色约数秒至l 而n ，当涂面出现明显褐色时，立即用蒸馏水冲洗，若加B 掖后显色较慢，可用微火加热，直至显揭色时立即水洗，自然干燥．
配制合格的染色荆（尤其是B 波）、充分洗去A 液再加B 液、水姐好。浪的染色时闻均丹．毛染色成欣的，．环节。
( 6 ）镜检干后用油镜观察。观察时，可从玻片的一端逐渐移至另一端，有时只在涂片的一定部位观察到鞭毛．
菌体呈深褐色，鞭毛显褐色、通常呈波浪形．
2 改良的Leifson氏染色法
( 1 ）载玻片的准备菌种材料的准备同硝酸银染色法．
( 2 ）制片用记号笔在载玻片反面将玻片分成3 一4 个等分区，在每一小区的一端放一小滴菌液．将玻片倾斜，让菌液流到小区的另一端，用滤纸吸去多余的菌液．室温或37 ℃ 温室自然千燥．
( 3 ）染色 加Leifson氏染色液覆盖第一区的涂面，隔数分钟后，加染液于第二区涂面，如此继续染第三，四区．间隔时间自行议定，其目的是为了确定最佳染色时间．在染色过程中仔细观家，当整个玻片都出现铁锈色沉淀、染料表面现出金色膜时，即直接用水轻轻冲洗（不要先倾去染料再冲洗，否则背景不清）．染色时间大约10min．自然千燥．
( 4 ）镜检干后用油镜观察
菌体和鞭毛均呈红色．
（二）运动性的观察
玻片的准备、菌种材料的准备同鞭毛染色法．
1 ．压滴法
( l ）制片 在洁净载玻片上加一滴无菌水，挑取一环菌液与水棍合，再加一环0 . 01 ％的美蓝水溶液与其混合均匀．用镊子取一沽净盖玻片，使其一边与菌液边缘接触，然后将盖玻片慢怪放下盖在菌液上．观察专性好氧菌时，可在放盖玻片时压人小气泡，以防止细菌因缺氧而停止运动．( 2 ）镜检先用低倍镜找到标本，再用高倍镜观察。也可用油镜观寮，用油镜时，盖玻片厚度不能超过017 ? ，观察时，要用略暗光线，
有鞭毛细菌可作直线、波浪式或翻滚运动，两个细菌之间出现明显的位移而与布朗运动或随水流动相区别．
2 ．悬滴法
（1）涂凡士林取沽净凹载玻片，在其四周涂少许凡士林
 ( 2 ）加菌液在盖玻片中央滴一小滴菌液．为便于观察时寻找曲液位t ，可用记号笔在菌液周围画上记号。菌液不能加得太多，为了便于观察，也可用接种环挑取一环菌液于益玻片中央. 
( 3 ）盖凹玻片将凹玻片的凹槽对准盖玻片中心的菌液，井轻轻盖在盖玻片上．轻轻按压使盖玻片与凹玻片粘合在一起，把液摘封闭在小室中。翻转凹玻片，使菌液滴惫在益玻片下并位于凹槽中央. 
（4） 镜检 先用低倍镜找到标本，并将液滴移至视野中央，然后用高倍镜观察．若用油镜观察，盖玻片厚度不能超过O . 17mm , ，并要十分细心，以免压碎盖玻片、报坏镜头．
五、实验报告
l 结果
你所观察的3 种细菌是否都有鞭毛？是否都能运动？鞭毛― 运动有无相关性？绘图表示有鞭毛细菌的形态特征．
2 ．思考题
( l ）用鞭毛染色法准确鉴定一株纽菌是否具有鞭毛，要注意哪些环节？
( 2 ) 悬滴法中，为什么要涂凡士林？为什么加的菌液不能大多？如果发现显微镜视野内大量细菌向一个方向流动，你认为是什么原因造成的？
   
   

 

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