微生物拟核的体内和体外染色观察

一、目的要求
1 ．学习并掌握用富尔根氏染色法进行体内观察微生物拟核的原理和方法．
2 初步了解和掌握提取细菌染色体DNA 及其体外观察的方法．
二、墓本原理
富尔根氏（Feulgen）染色法是根据席夫氏（Schiff） 的试剂进行的反应而建立的微生物拟核染色法。席夫氏试剂含有碱性复红和亚硫酸，碱性复红与亚硫酸结合后，失去醒式结构而变为无色，当DNA 经酸作用而生成的醛化合物与席夫氏试荆结合后，使醒式结构恢复，合成一种带紫红色
的碱性复红衍生物．此染色法对DNA具有特异性，微生物细胞用此法染色后，可在普通光学显微镜下原位观察到细胞内拟核的形态和位置。
富尔根氏染色法主要分两步：（a）将细胞用1 moL HCL温和水解．使DNA中的嗦吟碱与戊箱分开，放出戊糖的醛基；( b ）放出的戊搪醛基与席夫氏试荆作用后呈紫红色．
如果将微生物细胞裂解．使其拟核（即染色体DNA ）被抽提出来，通过溴化乙锭染色并进行琼脂特凝胶电泳，便可观察到释放到细胞外的染色体DNA . EB 是一种扁平分子染料，可特异性括人DNA 碱基对之间，在紫外线照射下，使DNA 呈现荧光，因而可观察到凝胶中的染色体DNA ，由干在提取过程中大分子染色休DNA 的随机断裂，所以经凝胶电泳后形成的是一条不整齐的浓的荧光带（图IV 一6 ) . 
用EB 染色法进行的体外观察染色体DNA也分
两步进行：〔 a ）将细胞裂解后抽提染色体DNA ; ( b ）通过含有EB 的琼脂精凝胶电泳在紫外光下观察染色体DNA荧光棒．
三、器材
1 ．菌种 酿酒酵母，大肠杆菌．
2 溶液或试剂1mol/L HCL2 ％徽酸，Schandiun固定液，亚硫酸水溶液、席夫氏试剂，TE缓冲液，10 % SDS，蛋白酶K ( 20 mg /ml ) , 5 mol/L NaCL，CTAB/NACL,酚／氯仿／异戊醇（25 : 24 : 1 ) , 异丙醇，70 ％乙醇，溴酚蓝加样缓冲液，TAE 电泳缓冲液．
3 仪器或其他用具台式高速离心机，5 ml塑料离心管，真空干澡器，俄酸燕气瓶等．
四、操作步骤
l 富尔根氏染色法
( l ）取培养8 一10h 的酿酒酵母涂片，室温下风干
( 2 〕 将涂片置于盛有2 ％锇酸的蒸气瓶口上，用俄酸蒸气固定5min ，然后放入加热至60℃ 的Schandiun固定液中10min 。
( 3 ）用水冲洗固定后的标本．然后放在60 ℃ 1mol/L HCL中水解8min，水洗．
( 4 ）用席夫氏试荆作用30~40 min , 
( 5 ）由席夫氏试荆中取出放在亚硫酸水溶液中洗5min . 
( 6 ）由亚硫酸水溶液中取出水洗，干燥后，用油镜观察．
2 DNA的抽提和溴化乙锭染色
( l ）取4.5ml大肠杆菌过夜培养液干5ml塑料离心管中，12 000 r/min 离心1~2 min ，弃上清．
( 2 ）将细胞沉淀悬浮于1 . 7 mlTE 缓冲液中．加入10 %SDS90ul和20mg/ml的蛋白酶K 9 ul ，混匀，37度保温lh . 
( 3 ）加入5mol/L NaCI 300 ul ，充分混匀，再加入240ulCTAB/NACL，混匀，置65℃ 水浴10 min 。
（4）加入等体积的酚／氯仿/异戊醇〔 25 ：24：l ）混匀，12 O00r ／min 离心5min
（5）将上清水相转人另一洁净的塑料离心管中，加0 . 6 倍体积的异丙醇使DNA 沉淀下来．
（6）快速离心数秒钟，弃上清，用沁外的乙醇淋洗DNA2次，将DNA沉淀经真空干燥后溶于300 ul TE缓冲液中．
用此法获得的染色体DNA 可用于限制性酶切等分子生物学操作．
( 7 ）取少量 （约3 ~5ul）提取的DNA样品（其余置于一20 ℃ 保存），加入3 ul溴酚蓝加样缓冲液，混匀后上样进行琼脂糖凝胶电泳1~2 h . 
琼脂锗中加有EB ．在电泳过程中，EB 将插人DNA 分子中，
( 8 ）戴上一次性塑料手套（EB 是强诱变剂）将凝胶取出置于紫外分析仪上观察染色体DNA 荧光带． 
五，实验报告
1 ．结果
( l ）根据自己的实验结果，绘图表示细胞内核的形态和位置．
( 2 ）绘图表示你所观察到的琼脂糖接胶中的染色体DNA 带。
2 思考题
( l ）大肠杆菌细胞内的染色体是环形的还是线形的？你从凝胶上观察到的体外染色体DNA 应是环形的还是线形的？为什么？
( 2 ）凝胶上显现的染色体DNA带为什么是不整齐的？
   
   

 

上一篇：鞭毛染色法及活细菌运动性的观察

下一篇：放线菌形态的观察