培养基的制备和高压蒸汽灭菌

   
   一、目的和要求
1 、明确培养基的配制原理，掌握配制培养基的方法和步骤
2、学习开掌握高压蒸汽灭菌的基本原理及操作方法
3、学习空器皿的包扎、棉塞的制作等实验前准备工作
二、原理
培养基：培养基是人工地将多种营养物质按照各种微生物生长的需要配制而成的一种混合营养物质，用以培养或分离各种微生物。
牛肉膏蛋白胨培养基是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基，有时又称为普通培养基，由于这种培养基中含有一般细菌生长繁殖所需要的最基本的营养物质，所以可供作微生物生长繁殖之用。基础培养基含有牛肉膏，蛋白胨和NaCl。其中牛肉膏为微生物提供碳源、能源、磷酸盐和维生素，蛋白胨主要提供氮源和维生素，而NaCl提供无机盐。由于这种培养基多用于培养细菌，因此要用稀酸或稀碱将其pH调至中性或微碱性，以利于细菌的生长繁殖。
按照培养基的物理状态，可将培养基分为：固体培养基、半固体培养基、液体培养基。
在液体培养基中加入凝固剂，如琼脂、明胶、硅胶等，即为固体培养基。以琼脂为例，一般固体培养基中，加入1.5%-2.0%。
在液体培养基中加入少量凝固剂即为半固体培养基。一般琼脂只需要加入0.2%-0.7%。
已经配制好的培养基必须立即灭菌，以防止其中的微生物生长而消耗营养成分和改变培养基的pH。
高压蒸汽灭菌：
是将待灭菌的物品放在一个密闭的加压灭菌锅内，通过加热，使灭菌锅隔套间的水沸腾而产生蒸汽。待水蒸汽急剧地将锅内的冷空气从排气阀中驱尽，然后关闭排气阀，继续加热，此时由于蒸汽不能溢出，而增加了灭菌器内的压力，从而使沸点增高，得到高于100℃的温度。导致菌体蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。
在同一温度下，湿热的杀菌效力比干热大，其原因有三：一是湿热中细菌菌体吸收水分，蛋白质较易凝固，因蛋白质含水量增加，所需凝固温度降低（表Ⅵ-2），二是湿热的穿透力比干热大（表Ⅵ-3）；三是湿热的蒸汽有潜热存在，每1克水在100℃时，由气态变为液态时可放出2．26kJ（千焦）的热量。这种潜热，能迅速提高被灭菌物体的温度，从而增加灭菌效力。
三、具体操作：
培养基的配制方法和步骤及注意事项
1.先在空烧瓶中加入所要配制总量的50%左右的水（合成培养基）。
2、称量：
▲未称的药品与称过的药品要分开来
▲药勺用完要洗干净放回原处，一种试剂用一把勺
▲按照配方正确称取各种原料放于烧杯中。若是合成培养基，各成份要逐一溶解。
▲称不溶性固形物时，应单独称，若量少的可以与无机盐一起称，但一定要混匀再分装。
3、溶化：
▲玻棒搅匀，加热溶解，最后定容
▲定容：可先加少量水溶解，倒入量筒，再补水到刻度
▲一般情况下培养基用自来水配制。
4、调pH值：用1N NaOH或1N HCl调pH，用pH试纸对照。不可反复调pH，否则会影响培养基的渗透压。
5、加琼脂粉：分装过程中要不断搅拌，以使每管的琼脂粉都能均匀。
6、分装：试管总长的1/4，三角瓶的1/2（装量指固体培养基）。注意不要污染棉塞、试管口。
7、              包扎：试管和三角烧瓶分别塞上棉塞并包上牛皮纸，包扎成捆，注明何种培养基、时间。
8、              灭菌备用：
▲培养基不能反复高温灭菌，否则会破坏其中的营养成分。
▲培养基灭菌后必须在35-370C下恒温培养24h，确定无菌生长，方可使用。
高压蒸汽灭菌步骤及注意点：
1．首先将内层灭菌桶取出，再向外层锅内加入适量的水。
2．放回灭菌桶，并装入待灭菌物品。
3．加盖，以两两对称的方式同时旋紧相对的两个螺栓。
4．水沸腾以排除锅内的冷空气。待冷空气完全排尽后，关上排气阀。
5、当锅内压力升到所需压力时，控制热源，维持压力至所需时间。本实验用 1．05kg/cm2，121．3℃，20分钟灭菌。
5．灭菌所需时间到后，切断电源或关闭煤气，让灭菌锅内温度自然下降，当压力表的压力降至0时，打开排气阀，旋松螺栓，打开盖子，
 6．将取出的灭菌培养基放入 37℃温箱培养24小时，经检查若无杂菌生长，即可待用。

 

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