定量菌株菌悬液制备方法

  在进行培养基的验收，检验培养基的灵敏度、生长率时，都需要用到定量菌株。细菌的个体很小，肉眼无法直接看到，我们所看到的培养基平板上的菌落、浑浊的液体培养基，都是数以亿计的细菌集合体。在初次进行低浓度定量菌株菌悬液（10-100CFU/mL或20-200CFU/mL）制作时，通常使用十倍或百倍稀释法进行制作。

  下面就为大家介绍十倍稀释法的具体操作步骤：

  1、将生理盐水（或磷酸盐缓冲液等）分装至试管中，每支装量为9mL（百倍稀释可用10mL，特殊情况也可使用9mL做近似百倍稀释），进行灭菌处理（121℃灭菌15-30min即可）；

  注：在进行厌氧菌（如生孢梭菌，产气荚膜梭菌）稀释时，选用0.1%蛋白胨水或pH7.0氯化钠蛋白胨缓冲液做为稀释剂效果更佳；若不在厌氧环境中操作，从开始稀释至使用菌悬液结束要控制在15min以内，时间过长会导致菌体死亡。

  2、将灭菌后装有9mL生理盐水的试管编号1，2，3，4，5，6，7，8。

  3、将一定量的菌加入至编号1的试管中制成第一稀释梯度菌悬液（通常称为10^-1梯度），使用旋涡振荡器混匀。

  4、吸取1mL10^-1梯度菌悬液至编号2的试管中，混合均匀，就得到了第二稀释度的菌悬液（通常称为10^-2梯度，若吸取10^-1梯度菌悬液100μL至10mL生理盐水管中，即为百倍稀释，可以直接得到10^-3梯度菌悬液）。

  5、以此类推，可以得到10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7、10^-8梯度菌悬液，每一支管的含菌量都是前一直管的1/10，第8支管的菌液浓度就是第1支管的千万分之一了，如果第一支试管含菌量是10⁹CFU/mL，第8支管就可以得到100CFU/mL左右浓度的菌悬液了。

  现在稀释方法有了，那么如何制备第一支试管的菌悬液及确定第一支试管中菌液的浓度呢？一般采用以下四种方法：

1.麦氏比浊法

  将一定量培养好的细菌转移到第一支试管中（可以用菌液，可以挑取菌落），制备成约5麦氏浊度的均一浑浊的菌悬液（约10⁹CFU/mL），稀释即可。

  优点：新手可直接上手操作

  缺点：不同细菌体积大小有差别，有些芽孢菌容易聚成团块不易制得均一悬液；不适用于真菌孢子悬液制备；

  注意事项：不同细菌的麦氏浊度与浓度之间存在差异，第一次试验之前最好先进行验证；麦氏浊度无法区分细菌死活，因此最好使用新活化的菌制备；真菌（酵母菌）体积较大，同等浊度下浓度约为细菌的1/20。

2、吸光度法

  细菌在600nm波长处具有最大吸光度，在一定浓度下，细菌的浓度与OD_600nm呈正比关系，因此可以通过测量OD_600nm值来确定菌悬液浓度。此方法更常用于测定菌液浓度（观察细菌生长曲线），也可在制备10⁵-10⁷CFU/mL的菌悬液时使用，不适用于低浓度菌悬液制备。

3、菌液稀释法

  将菌株接种至非选择性肉汤培养基中过夜培养，吸取1mL培养物至9mL生理盐水中制成10^-1梯度菌悬液（约10⁸CFU/mL），稀释至10^-6或10^-7即可得到10-100CFU/mL菌悬液。

  优点：操作简单

  缺点：菌数不稳定，受细菌种类、培养基影响较大；仅适合均匀浑浊生长的细菌或真菌；若培养过程发生污染，不易察觉。

  注意事项：不同菌株生长时间不同，在不同培养基中生长浊度也不同，如大肠埃希氏菌、金黄色葡萄菌、沙门氏菌等在TSB中过夜培养即可，乳酸菌通常需在MRS肉汤中培养48-72h，酵母菌、白色念珠菌需在SDB培养基中培养3-5天。酵母菌、芽孢菌通常在10^-5稀释度左右，就可以得到10-100CFU/mL的菌悬液。

4、菌苔稀释法

  从平板或斜面上挑取一定量的菌苔（2-3mm单个菌落，菌落偏小可多挑几个菌落）至9mL生理盐水中振荡均匀，制成10^-1梯度菌悬液（约10⁸CFU/mL），稀释至10^-7或10^-8即可得到10-100CFU/mL菌悬液。

  优点：操作简单，相比较于其他稀释方法，最大优势就是更容易准确控制菌数浓度；适用范围广，细菌、真菌均可采用此方法制备菌悬液。

缺点：需要尝试和经验

  注意事项：不同菌株制成的菌悬液浓度同样存在差异，初次进行特定菌株稀释时需要做验证；一般非芽孢细菌制成的10^-1梯度菌悬液约为10⁸-10⁹CFU/mL，而芽孢菌和酵母菌制成的10^-1梯度菌悬液约为10⁶-10⁷CFU/mL。

5、总结：

  初次进行菌液制备时，可以选用方法1和方法4，多做几个稀释度测试，熟练有经验后使用方法4进行菌液制备，可轻松准确制得10-100CFU/mL或20-200CFU/mL浓度菌悬液。

  制备好的菌悬液可在验证过的时间内使用，使用时间一般与稀释剂有关，接下来我们再来讲一下稀释剂的选择和应用：

1、0.85%生理盐水或0.9%氯化钠溶液：

  在国标中通常使用0.85%生理盐水，中国药典中常使用0.9%氯化钠溶液，二者效果无明显差别，可适用于绝大多数细菌或真菌的菌悬液或孢子悬液制作（孢子悬液较稳定一般可在2-8℃存放一个月或者更长时间）。

2、磷酸盐缓冲液：

  与生理盐水效果接近，可用于菌悬液制备和稀释，但更常用于样品的稀释。

3、0.1%蛋白胨水或pH7.0氯化钠蛋白胨缓冲液：

  相比较于生理盐水，此两种缓冲液对于产气荚膜梭菌、生孢梭菌等厌氧菌的效果更好，更能保持细菌的活性。该培养基因含有少量蛋白胨，细菌易发生繁殖导致菌数发生变化，通常制备的菌悬液需在短时间内使用（一般细菌建议在45min内使用，厌氧菌建议在15min内使用）。

  上述的方法主要讲解了细菌和真菌的菌悬液制备方法，但有时候我们需要制作一些特殊的悬液，例如霉菌的孢子悬液、芽孢悬液，那么该如何制作呢？

1、霉菌的孢子悬液
  将霉菌接种至沙氏琼脂（或马铃薯葡萄糖琼脂）斜面（或平板）进行培养至产丰富的孢子，加入稀释剂进行洗脱（也可用接种环直接挑取一环孢子至稀释液中），再用十倍或百倍稀释法制成适宜浓度菌悬液。
  注意事项：

（1）培养过程中不可密封培养，保持良好的透气性有利于霉菌的生长和产孢子；

（2）不同的培养基营养存在差别，霉菌生长后期，培养基内的营养逐渐耗尽后，霉菌倾向于开始产孢子，因此在培养过程中不同培养基产孢子时间存在差异；

（3）孢子容易在空气中漂浮扩散，因此若采用接种环挑取孢子时，应做好防扩散污染的措施。

2、芽孢悬液
  将芽孢菌接种至硫酸锰营养琼脂（或其他产芽孢培养基）36±1℃培养5-7天（或其他合适温度培养），刮取菌苔至稀释液中制成悬液，将菌悬液置于65℃中水浴30min（或沸水浴10min）杀死菌体，再用十倍稀释或百倍稀释法制成适宜浓度的芽孢悬液。
  注：制备好的菌悬液原则上应现制现用，但孢子悬液、芽孢悬液相对比较稳定，可以在2-8℃保存较长时间，可在经过验证的期限内使用。

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