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一、检验标准
《GB4789.13-2012 食品安全国家标准 食品微生物学检验 产气荚膜梭菌检验》
二、检验过程解析及注意事项
1.样品制备
无菌称取25g样品加入至含225mL0.1%蛋白胨水的均质袋中，均质1-2min，将制备好的样品液用含9mL0.1%蛋白胨水试管进行十倍系列稀释样液；
注意事项：产气荚膜梭菌为厌氧菌，暴露在空气中易死亡，因此从称样、制备样液、稀释、到倾注培养基进行培养整个过程要快速完成，如不能及时完成，可按标准要求置于2-5℃保存（数小时内）或加入缓冲-甘油氯化钠溶液置于-60℃冷冻保存。
2.分离计数
吸取制备好的样液加入至无菌空平皿中，加入约15mL的TSC培养基（冷却至50℃左右），混合均匀；待培养基凝固后，在上方覆盖约10mL的TSC培养基，凝固后置于厌氧环境内36±1℃培养20-24h；培养结束后，计数黑色菌落；
注意事项：
（1）注意倾注时的培养基温度和时间，培养基温度过高或操作时间过长都有可能导致产气荚膜梭菌死亡；
（2）覆盖培养基可防止菌落蔓延，并使产气荚膜梭菌菌落呈黑色（PS：部分产气荚膜梭菌若生长在培养基表面时会因产生的硫化氢逃逸，菌落呈现无色，导致漏检，覆盖培养基则可以留住硫化氢与培养基中的铁盐反应生成黑色的FeS，使菌落呈现黑色，因此必须要进行覆盖操作）。
3.分离纯化培养
用接种针（环）从TSC平板上挑取黑色菌落，接种至液体硫乙醇酸盐培养基中，36±1℃培养18-24h；
注意事项：液体硫乙醇酸盐培养基自身可形成厌氧环境，无需覆盖石蜡或置于厌氧环境培养（不可振荡培养，液体流动会破坏下层的厌氧环境），接种前注意氧化层的高度（可在临用前水浴加热驱氧），接种时需至氧化层以下，产气荚膜梭菌可在氧化层以下呈颗粒或条状生长，有时可见产气，在培养基表面生成大量气泡。详情请参考：液体硫乙醇酸盐培养基原理及注意事项
4.产气荚膜梭菌鉴定
鉴定试验：纯化后的可疑菌做革兰氏染色，并做暴烈发酵试验、乳糖-明胶试验和动力-硝酸盐试验。典型的产气荚膜梭菌为革兰氏阳性粗短的杆菌，有时可见芽孢，暴烈发酵试验阳性，乳糖阳性，明胶阳性，硝酸盐还原阳性，动力阴性。
暴烈发酵试验：图1中a，b为产气荚膜梭菌暴烈发酵试验结果，c为阴性对照，d为空白管。接种时使用移液管或移液枪吸取1mL的FTG培养物伸入至含铁牛奶试管中培养基液面下方，缓慢加入菌液，更易观察到明显的暴烈发酵现象。
图1暴烈发酵试验现象
乳糖-明胶试验：产气荚膜梭菌可发酵乳糖，使培养基变黄，并液化明胶，使培养基呈液态不凝固。
注意事项：
（1）产气荚膜梭菌为厌氧菌，此生化反应需大量接种更易看到试验结果，实际操作时若用接种针挑取FTG培养物直接接种需氧培养，可能会遇到由于接种量不足和需氧培养导致菌不生长的情况，可以采用吸取0.1mL的FTG培养物或挑取平板上的大量菌苔接种方式后厌氧培养，更易观察到试验结果；
（2）明胶的凝固点在30℃左右，因此在36℃培养结束时，明胶是呈液态的，所以必须要放入低温环境使培养基冷却，再观察培养基是否呈液态状；
（3）不同细菌液化明胶能力有差别，增菌接种量可以更快观察到明胶液化现象，因此遇到明胶不液化问题时，可以尝试增大接种量或延长培养时间再观察试验结果。
图2产气荚膜梭菌的乳糖-明胶试验现象
动力-硝酸盐试验：产气荚膜梭菌无动力，在培养基中沿穿刺线生长；硝酸盐还原阳性，加入硝酸盐还原试剂后变红。
注意事项：
（1）同乳糖-明胶试验，用接种针挑取FTG培养物穿刺接种需氧培养可能观察不到菌生长，可采用接种针挑取菌苔穿刺接种方式进行培养，再观察结果；
（2）观察硝酸盐还原试验时，若滴加试剂后不变红，原因有2：①由于细菌不还原硝酸盐（-），②细菌将硝酸盐还原为亚硝酸盐，又继续将亚硝酸盐还原为氮气、氨、氮氧化物等（+）；因此当出现滴加试剂不变红时，需要补加锌粉或锌粒，检测培养基中的硝酸盐是否存在。锌可以将硝酸盐还原为亚硝酸盐，加入锌之后若出现缓慢变红现象，说明培养基中有硝酸盐存在，未被细菌还原，可判为硝酸盐还原阴性；加入锌之后若没有颜色变化，说明培养基中的硝酸盐已全部被细菌还原，也可判为硝酸盐还原阳性。
图3产气荚膜所的动力-硝酸盐试验现象
三、试验结果说明及其他鉴定试验
检验结果在TSC上呈黑色菌落，革兰氏染色为阳性短杆菌，生化鉴定符合暴烈发酵（+），乳糖（+），明胶（+），动力（-），硝酸盐还原（+），即可判为产气荚膜梭菌。
在《GB8538-2016 食品安全国家标准 饮用天然矿泉水检验方法》标准中，对产气荚膜梭菌鉴定有一项卵黄试验，产气荚膜梭菌会产生卵磷脂酶，分解卵黄中的卵磷脂，在菌落周围形成沉淀环，该特征反应也可做为产气荚膜梭菌的鉴定补充试验。
a:金葡菌ATCC6538乳白色菌落无浑浊带
b:产气荚膜梭菌ATCC13124乳白至淡黄色菌落有较大浑浊带
图4产气荚膜梭菌卵黄试验现象
注：本文属海博生物原创，未经允许不得转载。
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