食品中大肠菌群的计数方法

一、大肠菌群简介

  大肠菌群是指一群37℃、24h发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧革兰氏阴性无芽胞杆菌。主要由肠杆菌科中四个属内的一些细菌所组成，即埃希氏菌属、柠檬酸杆菌属、克雷伯氏菌属以及肠杆菌属。该菌主要来源于人畜粪便，故以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生质量，推断食品中有否污染肠道致病菌的可能。

二、参考标准

  《GB4789.3-2016 食品安全国家标准 食品微生物学检验 大肠菌群计数》

三、检验方法及原理

  1.MPN法

  MPN法是统计学和微生物学结合的一种定量检测法。待测样品经系列稀释并培养后，根据其未生长的最低稀释度与生长的最高稀释度，应用统计学概率论推算出待测样品中大肠菌群的最大可能数。MPN法适用于大肠菌群含量较低的食品中大肠菌群的计数。

  2.平板计数法

  大肠菌群在固体培养基中发酵乳糖产酸，在指示剂的作用下形成可计数的红色或紫色，带有或不带有沉淀环的菌落。平板计数法适用于大肠菌群含量较高的食品中大肠菌群的计数。

四、检验流程

  （一）MPN法

  1、初发酵试验

  选择3个适宜的连续稀释度的样品匀液（液体样品可以选择原液），每个稀释度接种3管月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤，每管接种1mL（如接种量超过1mL，则用双料LST肉汤），36℃±1℃培养24h±2h，观察倒管内是否有气泡产生，24h±2h产气者进行复发酵试验（证实试验），如未产气则继续培养至48h±2h，产气者进行复发酵试验。未产气者为大肠菌群阴性。

  检验原理：胰蛋白胨在培养基中作为营养物质提供菌体细胞生长所需要的氮源、维生素、氨基酸及生长因子等；乳糖提供菌体细胞生长所需要的碳源；氯化钠维持体系渗透压平衡；磷酸盐为菌体生长提供相对稳定的酸碱缓冲体系；月桂基硫酸钠抑制非大肠菌群类细菌的生长。

  培养基用法：称取本品35.6克，加热溶解于1000mL蒸馏水中，分装到有倒立发酵管的20mm×150mm试管中，每管10mL，121℃高压灭菌15分钟，备用。质控菌株接种到LST肉汤管中，培养结果如图1所示。

  注意事项：液体样品可以选择原液；若是接种量需要超过1mL，则用双料LST肉汤。

图1 月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤微生物质控结果

  2、复发酵试验

  用接种环从产气的LST肉汤管中分别取培养物1环，移种于煌绿乳糖胆盐肉汤（BGLB）管中，36℃±1℃培养48h±2h，观察产气情况。产气者，计为大肠菌群阳性管。

  检验原理：蛋白胨提供碳氮源；乳糖是可发酵的糖类；牛胆粉和煌绿抑制非肠杆菌科细菌。

  培养基用法：称取本品40.0g，加热搅拌溶解于1000mL蒸馏水中，分装到有倒立发酵管的20mm×150mm试管，每管10mL，121℃高压灭菌15分钟，备用。质控菌株接种到BGLB肉汤管中，培养结果如图2所示。

图2 BGLB肉汤微生物质控结果

  3、结果判定

  根据证实为大肠菌群的阳性管数，查大肠菌群最可能数（MPN）检索表，报告每g (mL)大肠菌群的MPN值。

  确定最适的三个连续稀释度方法，在10^-1～10^-5五个连续稀释度中确定最适的三个连续稀释度方法如下：

  a）有一个以上的稀释度3管均为阳性。选择三管都是阳性结果的最高稀释度及其相连的两个更高稀释度（见示例a、b，表中带下划线的数字对应的接种样品量为最终选取的最适稀释度，下同）；

  b）在未选择的较高稀释度中还有阳性结果时，则顺次下移到下一个更高三个连续稀释度（见示例c）；

  如果中间有某个稀释度没有阳性结果，但更高稀释度有阳性结果，则将此阳性结果加到前一稀释度，进而确定三个连续稀释度（见示例d）；

  如果不能按照这个原则找到三个合适的稀释度，则选择前一个较低的稀释度（见表示例e）；

  c）没有任何一个稀释度3管均为阳性。如果没有一个稀释度的3管均为阳性，则选择三个最低稀释度（见示例f）；

  如果在更高的没有被选择的稀释度还有阳性结果，将此阳性结果加到选择的最高稀释度，进而确定三个连续稀释度（见示例g）。

  每g(mL)检样中大肠菌群最可能数（MPN）的检索表：

  举例说明：若粪大肠菌群的阳性管数的示例为3-3-2-0-1，则选择的稀释度为3-2-1，根据MPN检索表所得MPN数值为1500。

  （二）平板计数法

  1、平板计数

  选取2个～3个适宜的连续稀释度，每个稀释度接种2个无菌平皿，每皿1mL。同时取1mL生理盐水加入无菌平皿作空白对照。将15mL～20mL融化并恒温至46℃的结晶紫中性红胆盐琼脂(VRBA)约倾注于每个平皿中。小心旋转平皿，将培养基与样液充分混匀，待琼脂凝固后，再加3mL～4mLVRBA覆盖平板表层。翻转平板，置于36℃±1℃培养18h～24h。

  检验原理：蛋白胨和酵母浸粉提供碳氮源、维生素、生长因子和辅酶等其他营养物质；氯化钠维持均衡的渗透；乳糖为可发酵碳水化合物，可作为一种能量来源；3 号胆盐和结晶紫可抑制革兰氏阳性菌的生长；中性红为指示剂；琼脂是培养基的凝固剂。大肠菌群可以发酵乳糖产酸，在中性红指示剂作用下形成紫红色菌落。

  培养基用法：称取本品41.5g，加热溶解于1000mL蒸馏水中，煮沸不要超过2分钟。

  选取菌落数在15CFU～150CFU之间的平板，分别计数平板上出现的典型和可疑大肠菌群菌落（如菌落直径较典型菌落小）。典型菌落为紫红色，菌落周围有红色的胆盐沉淀环，菌落直径为0.5mm或更大，最低稀释度平板低于15CFU的记录具体菌落数。质控菌株接种到VRBA培养基中，培养结果如图3所示。

  注意事项：选取菌落数在15CFU～150CFU之间的平板，菌落形态应为为紫红色,菌落周围有红色的胆盐沉淀环,菌落直径为0.5mm或更大,最低稀释度平板低于15CFU的记录具体菌落数。

  2、证实试验

  从VRBA平板上挑取10个不同类型的典型和可疑菌落,少于10个菌落的挑取全部典型和可疑菌落。分别移种于BGLB肉汤管内,36℃±1℃培养24h～48h,观察产气情况。凡BGLB肉汤管产气,即可报告为大肠菌群阳性。质控菌株接种到BGLB肉汤管中，培养结果如图4所示。

图4

  3、平板计数法计数结果

  经最后证实为大肠菌群阳性的试管比例乘以计数的平板菌落数,再乘以稀释倍数,即为每g(mL)样品中大肠菌群数。若所有稀释度(包括液体样品原液)平板均无菌落生长,则以小于1乘以最低稀释倍数计算。

  举例说明：10-4样品稀释液1mL,在VRBA平板上有100个典型和可疑菌落,挑取其中10个接种BGLB肉汤管,证实有6个阳性管,则该样品的大肠菌群数为:100×6/10×104/g(mL)=6.0×105CFU/g(mL)。

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