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食品中大肠菌群的计数方法

王永兴、张辉
录入时间:2020-12-28 10:43:32 来源:青岛海博生物

一、大肠菌群简介


  大肠菌群是指一群37℃、24h发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧革兰氏阴性无芽胞杆菌。主要由肠杆菌科中四个属内的一些细菌所组成,即埃希氏菌属、柠檬酸杆菌属、克雷伯氏菌属以及肠杆菌属。该菌主要来源于人畜粪便,故以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生质量,推断食品中有否污染肠道致病菌的可能。


二、参考标准


  《GB4789.3-2016 食品安全国家标准 食品微生物学检验 大肠菌群计数》


三、检验方法及原理


  1.MPN法


  MPN法是统计学和微生物学结合的一种定量检测法。待测样品经系列稀释并培养后,根据其未生长的最低稀释度与生长的最高稀释度,应用统计学概率论推算出待测样品中大肠菌群的最大可能数。MPN法适用于大肠菌群含量较低的食品中大肠菌群的计数。


  2.平板计数法


  大肠菌群在固体培养基中发酵乳糖产酸,在指示剂的作用下形成可计数的红色或紫色,带有或不带有沉淀环的菌落。平板计数法适用于大肠菌群含量较高的食品中大肠菌群的计数。


四、检验流程


  (一)MPN法


  1、初发酵试验


  选择3个适宜的连续稀释度的样品匀液(液体样品可以选择原液),每个稀释度接种3管月桂基硫酸盐胰蛋白胨(LST)肉汤,每管接种1mL(如接种量超过1mL,则用双料LST肉汤),36℃±1℃培养24h±2h,观察倒管内是否有气泡产生,24h±2h产气者进行复发酵试验(证实试验),如未产气则继续培养至48h±2h,产气者进行复发酵试验。未产气者为大肠菌群阴性。


  检验原理:胰蛋白胨在培养基中作为营养物质提供菌体细胞生长所需要的氮源、维生素、氨基酸及生长因子等;乳糖提供菌体细胞生长所需要的碳源;氯化钠维持体系渗透压平衡;磷酸盐为菌体生长提供相对稳定的酸碱缓冲体系;月桂基硫酸钠抑制非大肠菌群类细菌的生长。


  培养基用法:称取本品35.6克,加热溶解于1000mL蒸馏水中,分装到有倒立发酵管的20mm×150mm试管中,每管10mL,121℃高压灭菌15分钟,备用。质控菌株接种到LST肉汤管中,培养结果如图1所示。


  注意事项:液体样品可以选择原液;若是接种量需要超过1mL,则用双料LST肉汤。


图1 月桂基硫酸盐胰蛋白胨(LST)肉汤微生物质控结果


  2、复发酵试验


  用接种环从产气的LST肉汤管中分别取培养物1环,移种于煌绿乳糖胆盐肉汤(BGLB)管中,36℃±1℃培养48h±2h,观察产气情况。产气者,计为大肠菌群阳性管。


  检验原理:蛋白胨提供碳氮源;乳糖是可发酵的糖类;牛胆粉和煌绿抑制非肠杆菌科细菌。


  培养基用法:称取本品40.0g,加热搅拌溶解于1000mL蒸馏水中,分装到有倒立发酵管的20mm×150mm试管,每管10mL,121℃高压灭菌15分钟,备用。质控菌株接种到BGLB肉汤管中,培养结果如图2所示。


图2 BGLB肉汤微生物质控结果


  3、结果判定


  根据证实为大肠菌群的阳性管数,查大肠菌群最可能数(MPN)检索表,报告每g (mL)大肠菌群的MPN值。


  确定最适的三个连续稀释度方法,在10-1~10-5五个连续稀释度中确定最适的三个连续稀释度方法如下:


  a)有一个以上的稀释度3管均为阳性。选择三管都是阳性结果的最高稀释度及其相连的两个更高稀释度(见示例a、b,表中带下划线的数字对应的接种样品量为最终选取的最适稀释度,下同);



  b)在未选择的较高稀释度中还有阳性结果时,则顺次下移到下一个更高三个连续稀释度(见示例c);



  如果中间有某个稀释度没有阳性结果,但更高稀释度有阳性结果,则将此阳性结果加到前一稀释度,进而确定三个连续稀释度(见示例d);



  如果不能按照这个原则找到三个合适的稀释度,则选择前一个较低的稀释度(见表示例e);



  c)没有任何一个稀释度3管均为阳性。如果没有一个稀释度的3管均为阳性,则选择三个最低稀释度(见示例f);



  如果在更高的没有被选择的稀释度还有阳性结果,将此阳性结果加到选择的最高稀释度,进而确定三个连续稀释度(见示例g)。



  每g(mL)检样中大肠菌群最可能数(MPN)的检索表:


  举例说明:若粪大肠菌群的阳性管数的示例为3-3-2-0-1,则选择的稀释度为3-2-1,根据MPN检索表所得MPN数值为1500。


  (二)平板计数法


  1、平板计数


  选取2个~3个适宜的连续稀释度,每个稀释度接种2个无菌平皿,每皿1mL。同时取1mL生理盐水加入无菌平皿作空白对照。将15mL~20mL融化并恒温至46℃的结晶紫中性红胆盐琼脂(VRBA)约倾注于每个平皿中。小心旋转平皿,将培养基与样液充分混匀,待琼脂凝固后,再加3mL~4mLVRBA覆盖平板表层。翻转平板,置于36℃±1℃培养18h~24h。


  检验原理:蛋白胨和酵母浸粉提供碳氮源、维生素、生长因子和辅酶等其他营养物质;氯化钠维持均衡的渗透;乳糖为可发酵碳水化合物,可作为一种能量来源;3 号胆盐和结晶紫可抑制革兰氏阳性菌的生长;中性红为指示剂;琼脂是培养基的凝固剂。大肠菌群可以发酵乳糖产酸,在中性红指示剂作用下形成紫红色菌落。


  培养基用法:称取本品41.5g,加热溶解于1000mL蒸馏水中,煮沸不要超过2分钟。


  选取菌落数在15CFU~150CFU之间的平板,分别计数平板上出现的典型和可疑大肠菌群菌落(如菌落直径较典型菌落小)。典型菌落为紫红色,菌落周围有红色的胆盐沉淀环,菌落直径为0.5mm或更大,最低稀释度平板低于15CFU的记录具体菌落数。质控菌株接种到VRBA培养基中,培养结果如图3所示。




  大肠埃希氏菌

弗氏柠檬酸杆菌





  阴沟肠杆菌 鼠伤寒沙门氏菌

图3


  注意事项:选取菌落数在15CFU~150CFU之间的平板,菌落形态应为为紫红色,菌落周围有红色的胆盐沉淀环,菌落直径为0.5mm或更大,最低稀释度平板低于15CFU的记录具体菌落数。


  2、证实试验


  从VRBA平板上挑取10个不同类型的典型和可疑菌落,少于10个菌落的挑取全部典型和可疑菌落。分别移种于BGLB肉汤管内,36℃±1℃培养24h~48h,观察产气情况。凡BGLB肉汤管产气,即可报告为大肠菌群阳性。质控菌株接种到BGLB肉汤管中,培养结果如图4所示。


图4


  3、平板计数法计数结果


  经最后证实为大肠菌群阳性的试管比例乘以计数的平板菌落数,再乘以稀释倍数,即为每g(mL)样品中大肠菌群数。若所有稀释度(包括液体样品原液)平板均无菌落生长,则以小于1乘以最低稀释倍数计算。


  举例说明:10-4样品稀释液1mL,在VRBA平板上有100个典型和可疑菌落,挑取其中10个接种BGLB肉汤管,证实有6个阳性管,则该样品的大肠菌群数为:100×6/10×104/g(mL)=6.0×105CFU/g(mL)。


  注:本文属海博生物原创,未经允许不得转载。

 

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