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粪大肠菌群计数标准解析

纪英姿
录入时间:2021-1-4 10:38:25 来源:青岛海博生物

一、参考标准


  根据《GB4789.39-2013 粪大肠菌群标准计数》中定义,粪大肠菌群是一群在44.5℃中培养24—48小时能发酵乳糖产酸产气的需氧和兼性厌氧革兰氏阴性无芽孢杆菌。


二、检验流程


  1、样本稀释


  固体和半固体样品:称取25g样品,置盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内,制成1:10的样品匀液。


  液体样品:以无菌吸管吸取样品25mL置盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶(瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠)中,充分混匀,制成1:10 的样品匀液。


  注意事项:样品匀液的pH值应在6.5~7.5之间,必要时分别用1 mol/L NaOH或1 mol/L HCl调节;根据对样品污染状况的估计,依次制成十倍递增系列稀释样品匀液。每递增稀释1次,换用1支1mL无菌吸管或吸头。从制备样品匀液至样品接种完毕,全过程不得超过15 min。


  2、初发酵试验


  每个样品,选择3个适宜的连续稀释度的样品匀液,每个稀释度接种3管月桂基硫酸盐胰蛋白胨(LST)肉汤,每管接种1mL,36℃±1℃培养24h±2h,观察倒管内是否有气泡产生,24h产气者进行复发酵试验,如未产气则继续培养至48h±2h。


  根据标准菌株对月桂基硫酸盐胰蛋白胨(LST)肉汤培养基进行验证,结果如图一:



a:大肠埃希氏菌ATCC25922,b:阴沟肠杆菌ATCC23355,c:弗氏柠檬酸盐杆菌ATCC43864

d:粪肠球菌ATCC29212,e:空白对照

图一 月桂基硫酸盐胰蛋白胨(LST)肉汤微生物质控结果

  

  注意事项:液体样品可以选择原液;若是接种量需要超过1mL,则用双料LST肉汤。


  3、复发酵试验


  用接种环从产气的LST肉汤管中分别取培养物1环,移种于预先升温至44.5℃的EC肉汤管中。将所有接种的EC肉汤管放入44.5℃±0.2℃培养箱内,培养24h±2h,记录EC肉汤管的产气情况。产气管为粪大肠菌群阳性,不产气为粪大肠菌群阴性。


  根据标准菌株对EC肉汤培养基进行验证,结果如图二:



a:大肠埃希氏菌ATCC25922,b:产气肠杆菌ATCC35029,c:大肠埃希氏菌CMCC44102

d:弗氏柠檬酸杆菌ATCC43864 e:粪肠球菌ATCC29212,f:金黄色葡萄球菌ATCC25923 g:空白对照

图二 EC肉汤微生物质控结果

 

  注意事项:定期以已知为44.5℃产气阳性的大肠埃希氏菌和44.5℃不产气的产气肠杆菌或其他大肠菌群细菌作阳性和阴性对照。


三、结果判定


  根据证实为粪大肠菌群的阳性管数,查粪大肠菌群最可能数(MPN)检索表,报告每g (mL)粪大肠菌群的MPN值。


  在10-1~10-5五个连续稀释度中确定最适的三个连续稀释度方法如下:


  a)有一个以上的稀释度3管均为阳性。选择三管都是阳性结果的最高稀释度及其相连的两个更高稀释度(见表B.1示例a、b,表中带下划线的数字对应的接种样品量为最终选取的最适稀释度,下同);



  b)在未选择的较高稀释度中还有阳性结果时,则顺次下移到下一个更高三个连续稀释度(见表B.1示例c);



  如果中间有某个稀释度没有阳性结果,但更高稀释度有阳性结果,则将此阳性结果加到前一稀释度,进而确定三个连续稀释度(见表B.1示例d);



  如果不能按照这个原则找到三个合适的稀释度,则选择前一个较低的稀释度(见表B.1示例e);



  c)没有任何一个稀释度3管均为阳性。如果没有一个稀释度的3管均为阳性,则选择三个最低稀释度(见表B.1示例f);



  如果在更高的没有被选择的稀释度还有阳性结果,将此阳性结果加到选择的最高稀释度,进而确定三个连续稀释度(见表B.1示例g)。



  每g(mL)检样中粪大肠菌群最可能数(MPN)的检索见表C.1



  举例说明:若粪大肠菌群的阳性管数的示例为3-3-2-0-1,则选择的稀释度为3-2-1,根据MPN检索表所得MPN数值为1500。


  注意事项:MPN检索表采用3个稀释度[0.1g(mL)、0.01g(mL)和0.001g(mL)]、每个稀释度接种3管。并且表内所列检样量如改用lg(mL)、0.1g(mL)和0.01g(mL)时,表内数字应相应降低10倍;如改用0.01g(mL)、0.001g(mL)、0.0001g(mL)时,则表内数字应相应增高10倍,其余类推。

 

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