单核细胞增生李斯特氏菌检验方法及结果判断

一、简介

  单核细胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）简称单增李斯特氏菌，是一种人畜共患病的病原菌。它能引起人畜的李氏菌的病，感染后主要表现为败血症、脑膜炎和单核细胞增多。它广泛存在于自然界中，食品中存在的单增李氏菌对人类的安全具有危险，该菌在4℃的环境中仍可生长繁殖，是冷藏食品威胁人类健康的主要病原菌之一，因此，在食品卫生微生物检验中，必须加以重视。

二、参考标准

  《GB 4789.30-2016 食品安全国家标准 食品微生物学检验 单核细胞增生李斯特氏菌检验》。

三、检验方法以及结果

  单核细胞增生李斯特氏菌定性检验程序见图1。

图1 单核细胞增生李斯特氏菌定性检验程序

  1.分离

  将样品进行梯度稀释后，选择合适的稀释度涂布李斯特氏菌显色平板和PALCAM琼脂平板，于36℃±1℃培养24h～48h。

  单增李斯特氏菌的典型菌落在PALCAM琼脂平板上为小的圆形灰绿色菌落，周围有棕黑色水解圈，有些菌落有黑色凹陷。在李斯特氏菌显色平板上为蓝色菌落，菌落周围有一不透明环。如图2所示：

A：PALCAM琼脂平板；B：李斯特氏菌显色平板

图2 单增李斯特氏菌在PALCAM琼脂平板和李斯特氏菌显色平板典型菌落特征

  2.染色镜检

  挑取纯培养的单个可疑菌落，进行革兰氏染色，单增李斯特氏菌为革兰氏阳性菌，镜检为紫色短杆状。如图3所示：

图3 单增李斯特氏菌革兰氏染色镜检结果

  3.动力试验

  挑取纯培养的单个可疑菌落穿刺SIM动力培养基，于25℃～30℃培养48h。单增李斯特氏菌有动力，在SIM培养基上方呈伞状生长。如图四所示：

图4 单增李斯特氏菌SIM动力试验结果

  4.过氧化酶试验

  挑取纯培养的单个可疑菌落，滴加3%过氧化氢酶试剂后，单增李斯特氏菌菌落在30s内产生大量气泡。如图5所示：

图5 单增李斯特氏菌过氧化氢酶试验结果

  5.生化鉴定

  选择过氧化氢酶阳性反应的菌落，继续使用海博单增李斯特氏菌的生化鉴定条进行生化鉴定，单增李斯特氏菌生化反应结果为木糖阴性、鼠李糖阳性、葡萄糖阳性、麦芽糖阳性、甘露醇阴性、七叶苷阳性、MR-VP阳性。如图6所示：

图6 单增李斯特氏菌生化鉴定条试验结果

  注意事项：MR试验需在培养结束后滴加甲基红试剂1滴，立即观察结果，出现红色为阳性反应；VP试验需在培养结束后滴加VP试剂（甲液0.3mL，乙液0.1mL），混匀后观察结果（4小时内），出现红色为阳性反应。

  6.溶血试验

  将新鲜的羊血琼脂平板底面划分为20～25个小格，挑取纯培养的单个可疑菌落刺种到血平板上，每格刺种一个菌落，并刺种阳性对照菌（单增李斯特氏菌、伊氏李斯特氏菌）和阴性对照菌（英诺克李斯特氏菌），穿刺时尽量接近底部，但不要触到底面，同时避免琼脂破裂。36℃±1℃培养24h～48h，于明亮处观察。

  单增李斯特氏菌呈现狭窄、清晰、明亮的溶血圈，英诺克李斯特氏菌无溶血圈，伊氏李斯特氏菌产生宽的、轮廓清晰的β-溶血区域。如图7所示：

A-1、A-2、A-3和A-4均为待测菌落；B：单增李斯特氏菌阳性对照；

C：伊氏李斯特氏菌；D：英诺克李斯特氏菌

图7 单增李斯特氏菌溶血试验结果

  7.协同溶血试验

  在羊血琼脂平板上平行划线接种金黄色葡萄球菌和马红球菌，挑取纯培养的单个可疑菌落垂直划线接种于平行线之间，垂直线两端不要触及平行线，距离1mm～2mm，同时接种单增李斯特氏菌、英诺克李斯特氏菌、伊氏李斯特氏菌，于36±1℃培养24h～48h。

  单增李斯特氏菌在靠近金黄色葡萄球菌处出现约2mm的β-溶血增强区域，伊氏李斯特氏菌在靠近马红球菌处出现约5～10mm的“箭头状”β-溶血增强区域，英诺克李斯特氏菌不产生溶血现象。如图8所示：

A：金黄色葡萄球菌；B：马红球菌；C：单增李斯特氏菌阳性对照

D和G：待测菌；E：英诺克李斯特氏菌；F：伊氏李斯特氏菌

图8 单增李斯特氏菌协同溶血试验结果

三、结果判定

  若待测菌在PALCAM琼脂平板上为小的圆形灰绿色菌落，周围有棕黑色水解圈，有些菌落有黑色凹陷；在李斯特氏菌显色平板上为蓝色菌落，菌落周围有一不透明环；镜检结果为革兰氏阳性杆菌；有动力、过氧化酶阳性、木糖阴性、鼠李糖阳性、葡萄糖阳性、麦芽糖阳性、甘露醇阴性、七叶苷阳性、MR-VP阳性，可初步判断为单增李斯特氏菌。

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