食品中沙门氏菌检验（2）—沙门氏菌生化鉴定

一、参考标准

  《GB4789.4-2016食品安全国家标准 食品微生物学检验 沙门氏菌检验》

二、沙门氏菌生化鉴定简介

  沙门氏菌生化反应较为复杂，不同的种群生化反应存在差异，参照标准可分为三步进行确认：第一步通过三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶反应进行初步筛选，第二步结合靛基质试验、尿素酶试验、氰化钾试验结果进行确认，若第二步仍不能确认鉴定结果，根据第一第二步的生化反应类型，可分为六种反应类型，再进行第三步的补充试验进行确认。

三、接种步骤

沙门氏菌生化鉴定结果判断流程图

  用接种针挑取沙门氏菌分离平板上的可疑菌落，划线并穿刺接种至三糖铁琼脂斜面，同时接种赖氨酸脱羧酶培养基及氨基酸脱羧酶对照培养基，此时可同步接种蛋白胨水（靛基质试验）、尿素酶培养基、氰化钾对照培养基及试验培养基，接种结束后划线至营养琼脂平板，置于相应的培养条件下进行培养。

  注意事项：挑取菌落时，要用接种针挑取可疑菌落中心，避免碰触到其他菌落造成污染；划线接种至营养琼脂平板培养后，注意观察菌落纯度，若出现了不同形态的菌落，说明挑取的菌落不纯，需挑取纯化好的菌落重新进行生化鉴定。

四、生化反应培养基介绍

  （1）三糖铁琼脂

  制备好的三糖铁琼脂应为红色透明固态的高层斜面，接种方式为斜面划线接种加底层穿刺接种。细菌产碱为红色，用“K”表示，产酸为黄色，用“A”表示。若斜面和底层均为红色（产碱），则记为“K/K”；若斜面为红色（产碱），底层黄色（产酸），则记为“K/A”；若斜面和底层均为黄色（产酸），则记为“A/A”；若底层有黑色出现，则为硫化氢+；若出现断层，则为产气+。

  大多数沙门氏菌在三糖铁上的反应为K/A，产气，底层变黑有硫化氢产生；少数不产硫化氢的沙门氏菌在三糖铁上的反应为K/A，产气，底层无黑色出现；极少数分解乳糖的沙门氏菌在三糖铁上的反应为A/A，产气，底层变黑有硫化氢产生。

  注意事项：三糖铁琼脂培养时，斜面部分需要与空气中的氧气发生氧化反应，因此必须选用透气性良好的试管塞；在使用即用型一次性试管时，需开盖透气培养，严禁密闭培养（密闭培养会导致原本应显红色的斜面变成黄色）。详情参考文章：三糖铁琼脂（TSI）试管使用及注意事项。

  （2）赖氨酸脱羧酶试验

  此反应必须同时接种氨基酸脱羧酶对照生化管，细菌进行赖氨酸脱羧酶反应时，首先分解培养基中的葡萄糖产酸使培养基变成黄色，然后再分解赖氨酸脱羧产碱，使培养基又变回紫色。因此，当氨基酸脱羧酶对照管变成黄色，赖氨酸脱羧酶生化管紫色时，即为赖氨酸脱羧酶反应阳性；当氨基酸脱羧酶对照管盒赖氨酸脱羧酶生化管均为黄色时，即为赖氨酸脱羧酶反应阴性。

 

  b、e、f：赖氨酸脱羧酶阳性反应，紫色；a、c、d：赖氨酸脱羧酶阴性反应，黄色

  甲型副伤寒沙门氏菌赖氨酸脱羧酶反应为阴性，其他沙门氏菌的赖氨酸脱羧酶反应均为阳性。

  注意事项：接种后需覆盖液体石蜡；必须同时接种氨基酸脱羧酶对照管；若对照管和氨基酸脱羧酶生化管均为紫色，说明试验菌可能为氧化型细菌或产碱型细菌，不能判断该反应的阴阳性。详情参考文章：赖氨酸脱羧酶试验原理及现象。

 （3）靛基质试验

 接种待测菌至蛋白胨水培养基中培养结束后，需滴加Kovacs靛基质试剂数滴，若出现玫红色反应，即为靛基质反应阳性。

a、b：靛基质阳性反应，有玫红色环；c、d：靛基质阴性反应，有黄色环；e：空白对照

  绝大多数沙门氏菌靛基质反应为阴性，个别沙门氏菌为靛基质阳性变体。

  （4）尿素酶试验

  接种细菌培养结束后，若培养基变玫红色，说明细菌能够分解尿素产碱，即为尿素酶阳性反应，若培养基仍为橙红色或变黄，说明细菌不分解尿素，即为尿素酶阴性反应。

a、b、c、e：尿素酶阴性反应，变黄或橙红色；d：尿素酶阳性反应，变玫红色。

  几乎所有的沙门氏菌尿素酶均为阴性反应，极少出现尿素酶阳性的变体沙门氏菌。

  （5）氰化钾试验

  需同时接种氰化钾对照生化管，若试验菌在无氰化钾的对照管生长（浑浊），在含氰化钾的试验管不生长（澄清），则为氰化钾反应阴性；若试验菌在对照管和试验管均能生长（浑浊），则为氰化钾反应阳性。

d：氰化钾阳性反应，浑浊生长；a、b、c：氰化钾阴性反应，澄清不生长

  注意事项：氰化钾为剧毒产品，操作时需做好防护措施，建议使用商品化培养基更安全；若自行购买氰化钾配制培养基，需格外小心，若出现泄漏，可使用次氯酸钠溶液、84消毒液、漂白粉等进行应急处理。

  （6）甘露醇、山梨醇、水杨苷、卫矛醇发酵：变黄为阳性反应，不变色或变蓝为阴性反应。

a、b、d：糖醇发酵阳性，变黄；c、e：阴性反应，仍为蓝绿色

  （7）丙二酸盐利用试验：变蓝为阳性反应，不变色或变黄为阴性反应。

b、c：丙二酸盐利用试验阳性，变蓝；a：丙二酸盐利用试验阴性，不变色

  （8）ONPG：变黄为阳性反应，不变色为阴性反应。

a、b、e、f：ONPG阳性反应，变黄；c、d、g：ONPG阴性反应，不变色

五、鉴定结果判断

  1.若三糖铁反应出现K/K，可直接排除沙门氏菌；

  2.若三糖铁反应出现A/A，赖氨酸脱羧酶为阴性，可直接排除沙门氏菌；

  3.若三糖铁反应出现A/A，同时赖氨酸脱羧酶为阳性，或三糖铁出现K/A，需结合硫化氢、靛基质、尿素酶、KCN、赖氨酸脱羧酶试验结果进行下一步判断。

  （3.1）若出现以下生化反应结果（H2S通过三糖铁底层是否变黑进行记录判断），可直接判断为典型沙门氏菌属。若KCN、赖氨酸、尿素酶三项有至少两项与下表不符合，可直接排除沙门氏菌。

H2S	靛基质	尿素酶	KCN	赖氨酸
+	-	-	-	+

典型沙门氏菌生化反应：H2S+，靛基质-，尿素酶-，KCN-，KCN对照浑浊，赖氨酸脱羧酶+，氨基酸脱羧酶对照变黄

  （3.2）若出现以下生化反应结果（靛基质阳性），有可能为沙门氏菌靛基质阳性变体，需补做甘露醇、山梨醇发酵，并做血清学试验。若甘露醇、山梨醇发酵结果为阳性，血清学试验凝集，可确认为沙门氏菌。

H2S	靛基质	尿素酶	KCN	赖氨酸
+	+	-	-	+

  靛基质阳性变体沙门氏菌生化反应：H₂S+，靛基质+，尿素酶-，KCN-，KCN对照浑浊，赖氨酸+，氨基酸脱羧酶对照变黄，山梨醇+，甘露醇+

  （3.3）若出现以下生化反应（尿素酶阳性），有可能为沙门氏菌个别突变体，需做血清学试验。若血清学试验符合，可确认为沙门氏菌。

H2S	靛基质	尿素酶	KCN	赖氨酸
+	-	+	-	+

尿素酶变体沙门氏菌生化反应：H2S+，靛基质-，尿素酶+，KCN-，KCN对照浑浊，赖氨酸+，氨基酸脱羧酶对照变黄

  （3.4）若出现以下生化反应（硫化氢阴性），有可能为不产硫化氢沙门氏菌，需补做ONPG试验。若ONPG为阴性，可确认为沙门氏菌。

H2S	靛基质	尿素酶	KCN	赖氨酸
-	-	-	-	+

不产硫化氢沙门（非甲型副伤寒沙门氏菌）生化反应：H2S-，靛基质-，尿素酶-，KCN-，KCN对照浑浊，赖氨酸+，赖氨酸脱羧酶对照变黄，ONPG-

  （3.5）若出现以下生化反应（硫化氢阴性，同时赖氨酸脱羧酶阴性），有可能为甲型副伤寒沙门氏菌，需做血清学试验。若血清学试验符合甲型副伤寒沙门氏菌特征，可确认为甲型副伤寒沙门菌。

H2S	靛基质	尿素酶	KCN	赖氨酸
-	-	-	-	-

甲型副伤寒沙门菌生化反应：H2S-，靛基质-，尿素酶-，KCN-，KCN对照浑浊，赖氨酸-，氨基酸脱羧酶对照变黄

  （3.6）若出现以下生化反应（KCN阳性），可能为沙门氏菌IV群或V群，需补做卫矛醇、山梨醇、水杨苷、ONPG、丙二酸盐试验。若生化鉴定结果符合IV型或V型，可确认为沙门氏菌。

H2S	靛基质	尿素酶	KCN	赖氨酸
+	-	-	+	+

   沙门氏菌IV群和V群生化反应：

项目	卫矛醇	山梨醇	水杨苷	ONPG	丙二酸盐
沙门IV型	-	+	+	-	-
沙门V型	+	+	-	+	-

  沙门氏菌IV群在HBI沙门氏菌生化鉴定条上的反应结果：靛基质-，尿素酶-，KCN+，KCN对照浑浊，赖氨酸+，氨基酸脱羧酶对照变黄，甘露醇+，山梨醇+，水杨苷+，丙二酸盐-，ONPG-，卫矛醇-。

  沙门氏菌V群在HBI沙门氏菌生化鉴定条上的反应结果：靛基质-，尿素酶-，KCN+，KCN对照浑浊，赖氨酸+，氨基酸脱羧酶对照变黄，甘露醇+，山梨醇+，水杨苷-，丙二酸盐-，ONPG+，卫矛醇+。

  附：食品中沙门氏菌检验解析（1）—沙门氏菌分离 点击查看

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