食品中志贺氏菌的检验（下）

一、生化实验

  1、用已培养的营养琼脂斜面上生长的菌苔，进行生化实验，即β-半乳糖苷酶、尿素、赖氨酸脱羧酶、鸟氨酸脱羧酶、水杨苷分解和七叶苷分解试验。

  ①β-半乳糖苷酶试验

  由于某些志贺氏菌可产生-半乳糖苷酶，能分解邻硝基酚-半乳糖苷(ONPG)，生成黄色的邻硝基酚，使培养基由无色变为黄色，以此可鉴定部分志贺氏菌，由实验可得，除了宋内氏菌和痢疾志贺氏菌1型，鲍氏志贺氏菌13型的β-半乳糖苷酶为阳性以外，其余生化试验志贺氏菌属的培养物均为阴性结果。如图1。

该痢疾志贺氏菌菌株编号为CMCC51252，不为痢疾志贺氏菌1型

图1

  ②尿素试验

  某些细菌能产生尿素酶，将尿素分解、产生2个分子的氨，使培养基变为碱性，酚红呈粉红色。由于志贺氏菌不能产生尿素酶，因此志贺氏菌属的培养物皆为阴性，以此来区分志贺氏菌属与其他能产生尿素酶的细菌（如，普通变形杆菌）。如图2。

图2

  ③赖氨酸脱羧酶试验

  具有氨基酸脱羧酶的细菌，能分解氨基酸使其脱羧生成胺(赖氨酸→尸胺)和二氧化碳，使培养基变碱，使指示剂显示出来。由于细菌发酵葡萄糖产酸，在培养初期培养基和对照培养基呈黄色，继续培养时，若氨基酸经脱羧或水解产生胺类则培养基变碱，呈紫色或紫红色，即为阳性反应；如至培养末期培养基如同对照管一如至培养末期培养基如同对照管一样均呈黄色，则判为阴性反应。由于志贺氏菌属的细菌不具备氨基酸脱羧酶，因此志贺氏菌属的培养物均为阴性结果。如图3。

图3

  ④鸟氨酸脱羧酶试验

  具有赖氨酸脱羧酶的细菌，使鸟氨酸脱去羧基，生成腐胺，从而使培养基变碱性并通过指示剂变色来观察。由于细菌发酵葡萄糖产酸，在培养初期培养基和对照培养基呈黄色，继续培养时，若氨基酸经脱羧或水解产生胺类则培养基变碱，呈紫色或紫红色，即为阳性反应；如至培养末期培养基如同对照管一样均呈黄色，则判为阴性反应。在志贺氏菌的检验中宋内氏志贺氏菌、鲍氏志贺氏菌13型的鸟氨酸为阳性，其余志贺氏菌属的培养物均为阴性结果。如图4。

图4

  ⑤水杨苷分解试验

  若细菌可将水杨苷分解为成葡萄糖和水杨醇，则使溶液pH下降，指示剂颜色变黄；若不能发酵水杨苷，则溶液颜色不变。在志贺菌属的检验中，志贺菌属的培养物皆为阴性。如图5。

图5

  ⑥七叶苷分解

  若细菌可将七叶苷分解为葡萄糖与七叶素，七叶素与培养基中的二价铁离子反应，生成黑色的化合物，使培养基变黑(例如：粪肠球菌)。在志贺菌属的检验中，七叶苷分解实验志贺氏菌属的培养物均为阴性结果。如图6。

图6

  2、由于福氏志贺氏菌6型的生化特性和痢疾志贺氏菌或鲍氏志贺氏菌相似，必要时还需加做靛基质、甘露醇、棉子糖、甘油试验。

  ①靛基质试验

  福氏志贺氏菌型细菌可分解色氨酸形成吲哚（靛基质）。吲哚和二甲基苯甲醛反应生成玫瑰红色吲哚环，以大肠埃希氏菌为例，大肠埃希氏菌在24小时时即可呈现阳性反应，而福氏志贺氏菌则需要48小时才出现阳性结果，因此福氏志贺氏菌判定为迟缓阳性。如图7。

该实验结果为24小时时的实验结果

图7

  ②甘露醇试验

  若细菌能发酵甘露醇，则产酸使溶液pH下降，指示剂颜色变黄；若不能发酵甘露醇，则溶液颜色不变。在志贺菌属的检验中，福氏志贺氏菌、鲍氏志贺氏菌和宋内志贺氏菌为甘露醇阳性反应，痢疾志贺氏菌为阴性反应，其中福氏4型和6型为常见甘露醇阴性变种。如图8。

该福氏志贺氏菌不为福氏4型和6型

图8

  ③棉子糖试验

  若细菌能发酵棉子糖，则产酸使溶液pH下降，指示剂颜色变黄；若不能发酵棉子糖，则溶液颜色不变。在志贺菌属的检验中，福氏志贺氏菌和宋内志贺氏菌为棉子糖阳性反应，痢疾志贺氏菌和鲍氏志贺氏菌为阴性反应。如图9。

图9

  ④甘油试验

  若细菌能利用甘油，则产酸使溶液pH下降，指示剂颜色变黄；若不能利用甘油，则溶液颜色不变。在志贺菌属的检验中，痢疾志贺氏菌与鲍氏志贺氏菌为迟缓阳性反应，福氏志贺氏菌为阴性反应，宋内志贺氏菌实试验结果无法确认，即有阳性反应也有阴性反应，以标准菌株宋内志贺氏菌CNCC（B）51592为例，其生化反应为阳性反应，溶液颜色为黄色。培养18小时时实验结果图10所示，其中痢疾志贺氏菌为迟缓阳性在18小时时不能呈现完全阳性现象。

图10

  3、此外，也可做革兰氏染色检查和氧化酶试验，应为氧化酶阴性的革兰氏阴性杆菌。生化反应不符合的菌株， 即使能与某种志贺氏菌分型血清发生凝集，仍不得判定为志贺氏菌属。

  在志贺氏菌检验的生化实验中结果总结如表2所示：

二、附加生化实验

  由于某些不活泼的大肠埃希氏菌（anaerogenic E.coli）、A-D（Alkalescens-D isparbiotypes 碱性-异型）菌的部分生化特征与志贺氏菌相似，并能与某种志贺氏菌分型血清发生凝集；因此前面生化实验符合志贺氏菌属生化特性的培养物还需另加葡萄糖铵、西蒙氏柠檬酸盐、粘液酸盐试验(36℃培养24h～48h)。

  ①葡萄糖铵试验

  若细菌可利用铵盐作为唯一氮源，可在此培养基中生长良好，并分解葡萄糖产酸，使培养基变黄，呈阳性反应；不能利用铵盐作为唯一氮源的细菌在此培养基中不生长，培养基颜色不变，即为阴性反应。在葡萄糖铵的试验中，志贺菌属的培养物均为阴性结果。如图11。

图11

  ②西蒙氏柠檬酸盐试验

  某些细菌可利用铵盐作为唯一氮源，并同时利用柠檬酸盐为唯一碳源以提供能量，进行生长繁殖。柠檬酸盐被分解，产生碳酸盐和碳酸氢盐，而铵盐被分解产生氨，故培养基变碱性，通过指示剂变色反应，得以鉴别。在西蒙氏柠檬酸盐的试验中，志贺菌属的培养物均为阴性。如图12。

图12

  ③粘液酸盐试验试验

  若细菌能够利用粘液酸分解产酸，使指示剂变黄色，反之，培养基不变色。在粘液酸盐试验中，若粘液酸盐测试肉汤实验结果为培养基变黄色，粘液酸盐质控肉汤（对照）培养基不变色，则判定该菌的实验结果为阳性反应。反之，为阴性反应。如图13。

图13

  在志贺氏菌检验中附加生化实验结果总结如表3所示：

三、补充说明

  在进行志贺氏菌的生化鉴定时，也可使用志贺氏菌生化鉴定条对其生化反应进行判断，志贺菌生化鉴定条中包含了所有志贺菌生化鉴定所需要的培养基，方便快捷高效。如图14所示，为宋内志贺氏菌18小时时的生化实验结果（“+”表示实验结果为阳性，“-”表示实验结果为阴性）：

图14

四、血清学鉴定

  1、抗原的准备

  志贺氏菌属没有动力，所以没有鞭毛抗原。志贺氏菌属主要有菌体（O）抗原。菌体O抗原又可分为型和群的特异性抗原。一般采用 1.2%～1.5%琼脂培养物作为玻片凝集试验用的抗原。

  注意事项：①一些志贺氏菌如果因为K抗原的存在而不出现凝集反应时，可挑取菌苔于1mL生理盐水做成浓菌液，100℃煮沸15min～60min去除K抗原后再检查。②D群志贺氏菌既可能是光滑型菌株也可能是粗糙型菌株，与其他志贺氏菌群抗原不存在交叉反应。与肠杆菌科不同，宋内氏志贺氏菌粗糙型菌株不一定会自凝。宋内氏志贺氏菌没有K抗原。

  2、凝集反应

  在玻片上划出2个约1cm×2cm的区域，挑取一环待测菌，各放1/2环于玻片上的每一区域上部，在其中一个区域下部加1滴抗血清，在另一区域下部加入1滴生理盐水，作为对照。再用无菌的接种环或针分别将两个区域内的菌落研成乳状液。将玻片倾斜摇动混合1 min，并对着黑色背景进行观察， 如果抗血清中出现凝结成块的颗粒，而且生理盐水中没有发生自凝现象，那么凝集反应为阳性。如果生理盐水中出现凝集，视作为自凝。这时，应挑取同一培养基上的其他菌落继续进行试验。如果待测菌的生化特征符合志贺氏菌属生化特征，而其血清学试验为阴性的话，则按注1进行试验。

  福氏志贺氏菌各型和亚型的型抗原和群抗原鉴别见表 4。

五、结果报告

  综合以上生化试验和血清学鉴定的结果，报告样品中检出或未检出志贺氏菌。

  注：本文依据《GB 4789.5-2012食品安全国家标准 食品微生物检验 志贺氏菌检验》

  注：本文属海博生物原创，未经允许不得转载。

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