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菌落总数测定的要求和注意事项

许英俊
录入时间:2021-6-1 10:50:14 来源:青岛海博生物

一、定义


  菌落总数是指在被检样品的单位重量(g)、容积(mL)或表面积内,所含能于某种固体培养基上,在一定条件下培养后所生成的细菌集落的总数。


二、菌落总数测定的意义


  菌落总数主要是作为判定样品被细菌污染程度的标记,也可以应用这一方法观察样品中细菌的性质以及细菌在样品中繁殖的动态,以便对被检样品进行卫生学评价时提供科学依据。


三、菌落总数测定的相关标准


  在食品、药品、矿泉水、饮用水和化妆品检测等很多领域,对样品中菌落总数的测定都有相应的要求,涉及的标准主要有:


  《中华人民共和国国家标准:食品安全国家标准:食品微生物学检验 菌落总数测定(GB 4789.2-2016)》


  《GB/T 5750.12-2006 生活饮用水标准检验方法 微生物指标》


  《GB 17401-2003 膨化食品卫生标准》


  《中华人民共和国国家环境保护标准 HJ 1000-2018 水质 细菌总数的测定 平皿计数法》


  《化妆品安全技术规范》(2015版)


四、不同标准的检测要求


  本文主要以《GB4789.2-2016食品安全国家标准:食品微生物学检验 菌落总数测定》和《化妆品卫生规范》(2015版)为对象,对比说明不同标准对这一测定的不同要求(表1)。


表1 GB4789.2-2016食品卫生检验和化妆品卫生规范对菌落总数测定的要求比较

标准

GB4789.2-2016

化妆品卫生规范2015

培养箱

36℃±1℃;30℃±1℃

36℃±1℃

水浴箱

46℃±1℃

55℃±1℃

培养基

平板计数琼脂(HB0101)

卵磷脂吐温80-营养琼脂培养基(HB5182)

TTC卵磷脂吐温80-营养琼脂培养基(HB5189)

稀释液

磷酸盐缓冲液或无菌生理盐水

无菌生理盐水

样品制备

固体/半固体

固体(水溶性/油性)

/

膏、霜、乳剂半固体(亲水性/疏水性)

液体

液体

25+225

10+90

均质8000r/min-1000r/min或拍击式均质器1-2min

均质混匀

匀液

混匀悬液液/静置,取上清液

加样

沿管壁缓缓注入(尖端勿触及稀释液面)

尖端勿触及稀释液面

倾注

15-20ml

约15ml

46℃

45℃-50℃

培养

36℃±1℃,48±2h;

水产品30℃±1℃,72±3h

36℃±1℃,48±2h


  (1)培养基


  食品标准要求:平板计数琼琼脂(参考http://www.hopebiol.com/asphtml/product1.htm)。


  化妆品标准要求:卵磷脂吐温80-营养琼脂培养基(参考http://www.hopebiol.com/asphtml/product279.htm或TTC卵磷脂吐温80-营养琼脂培养基(参http://www.hopebiol.com/asphtml/product286.htm)。


  (2)稀释液


  食品标准列出可用磷酸盐缓冲液或无菌生理盐水,但化妆品标准只列出无菌生理盐水,有些标准中规定使用缓冲蛋白胨水作为稀释液。








  

  (3)样品制备


  两个标准都对样品进行了大致分类,固体、半固体和液体,但化妆品因其特殊性,在检验时,要根据不同的性质(亲水性/疏水性)和不同的剂型(膏、霜、乳剂),按照标准,对样品进行不同的前期处理。


  (4)样品取量


  食品标准要求的样品和稀释液用量为25(g/ml)+225(ml),化妆品规范中的用量为10(g/ml)+90(ml)。


  (5)加样


  食品检验标准要求所加液体必须是充分混匀的匀液,但化妆品检测中,有些是要吸取混匀的悬液,有些则要取上清液。


  (6)倾注温度


  食品标准规定倾注培养基温度为46℃,化妆品检验标准中,要求在45℃-50℃之间即可。


  (7)培养温度不同


  通常菌落总数检验要求36℃±1℃,48±2h;但GB4789.2-2016标准中还加入了30℃±1℃,72±3h,这主要考虑到食品中的水产品因来自淡水或海水,水底温度较低,因而制定水产品细菌方面的卫生标准时,是用30℃作为培养的温度。实验证明,对于同种样品,36℃培养和30℃培养结果差别较大,而同样的水产品样品在30℃条件下培养48h和培养72h结果也有差别。


五、注意事项


  (1)为了控制污染,需做空白对照实验,在取样进行检验的同时,于工作台上打开一块琼脂平板,其暴露的时间应与该检样从制备、稀释到加入平皿时所暴露的最长的时间相当,然后与加有检样的平皿一并置于温箱内培养,以了解样品在检验操作过程中有无受到来自空气的污染。


  (2)加入平皿内的检样稀释液(特别是10-1的稀释液),有时带有食品颗粒,在这种情况下,为了避免与细菌菌落发生混淆,可作一样品稀释液与琼脂混和的平皿,不经培养,而于4℃环境中放置,以便在计数捡样菌落时用作对照。


  (3)为了防止检样中食品颗粒与菌落混淆,也可在已溶化而保温于46℃水浴内的琼脂中,按每100mL加lmL0.5%氯化三苯四氮唑(2,3,5triphenyltetrazolium chloride,TTC)水溶液之量加入适量的TTC。


  培养后,如系食品颗粒,不见变化,如为细菌,则生成红色菌落。配好的TTC溶液,应先用来与不加TTC的作对照,以观察其对计数是否有不利的作用(TTC在一定浓度下对革兰氏阳性菌有抑制作用)。


  随着人们对食品、药品等的日益关注,越来越多的检测方式被广泛地应用到各领域质量检测中,其中,菌落总数是一种重要的检测指标。但是针对不同的检测对象,又分别有各自适用的检测标准,从培养基的使用到培养条件的选择,都会略有区别,在实际检测时,一定要根据检测对象来选择使用的检测标准作为依据,注意各种影响因素,严格操作规程进行实验室检测,这样得出的结论才更客观、科学、可信。


  注:本文属海博生物原创,未经允许不得转载。

 

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