大肠菌群的快速检测方法及结果判断

一、大肠菌群简介

  大肠菌群是革兰氏阴性、无芽孢、氧化酶阴性的杆状细菌，为需氧和兼性厌氧，可在有胆盐（或具有其他抑制生长的表面活性剂）存在的情况下生长，通常可在36℃士2℃发酵乳糖并产酸和醛。具有β-半乳糖苷酶，在本标准设定的条件下，大肠菌群为能分解β-半乳糖苷，使培养基发出荧光或生成紫色（或红色）菌落。主要由肠杆菌科中四个属内的一些细菌所组成，即埃希氏菌属、柠檬酸杆菌属、克雷伯氏菌属以及肠杆菌属。

  大肠菌群主要来源于人畜粪便，故以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生质量，推断食品中有否污染肠道致病菌的可能。如果大肠菌群存在于食品中，表明未作有效的消毒处理、加工后保存条件不良或消毒后又受到污染。快速检验这些细菌，有助于食品的卫生管理，维护消费者的食用安全。

二、参考标准

  《GBT 4789.32-2002 大肠菌群的快速检测》

三、检验原理

  3.1 最可能（MPN）法

  大肠菌群可产生β-半乳糖苷酶，分解液体培养基中的酶底物—4-甲基伞形酮-β-半乳糖苷（以下简称MUGal），使4-甲基伞形酮游离，因而，在波长366nm的紫外光灯照射下呈现蓝色荧光。

  3.2 平板法

  大肠菌群可产生β-半乳糖苷酶，分解培养基中的酶底物—茜素-β-D-半乳糖苷（以下简称Aliz-gal），使茜素游离并与固体培养基中的铝、钾、铁、钱离子结合形成紫色（或红色）的鳌合物，使菌落呈现相应的颜色。

四、检验方法以及结果分析

  大肠菌群快速检验程序见图1。

图1 大肠菌群快速检验程序

  4.1 大肠菌群的MPN计数

  4.1.1 检验方法

  选择3个适宜的连续稀释度的样品匀液（液体样品可以选择原液），每个稀释度接种3管MUGal肉汤管，每管接种1mL（如接种量超过1mL，则用双料MUGal肉汤管），同时另取2支MUGal肉汤管（或双料MUGal肉汤管）加入与样品稀释液等量的上述无菌磷酸盐缓冲液（或生理盐水）作空白对照。将接种后的培养管置于37±1℃培养箱培养18h-24h。

  将培养管置于暗处，用波长366nm的紫外光灯照射，如显蓝色荧光，为大肠菌群阳性管；如未显蓝色荧光，则为大肠菌群阴性管。

  培养基检验原理：胰蛋白胨提供碳源和氮源满足细菌生长的需求；氯化钠可维持均衡的渗透压；磷酸二氢钾和磷酸氢二钾是培养基pH缓冲剂；月桂基硫酸钠可以抑制革兰氏阳性菌的生长；大肠菌群可产生β-半乳糖苷酶，分解液体培养基中的酶底物4-甲基伞形酮-β-D-半乳糖苷MUGal，使4-甲基伞形酮游离，在波长366nm紫外灯照射下呈现蓝色荧光。

  培养基用法：称取本品30.7克，加热搅拌溶解于1000mL蒸馏水中，分装于20mm×150mm试管中，每管9mL，116℃高压灭菌10分钟，待培养基冷却后，以无菌操作于每管培养液内加入0.1mL经无菌水稀释的500ug/mL头孢磺啶液，备用。

  质控菌株接种到MUGal肉汤管中，培养结果如下图所示：

正常光线下

a:空白对照；b:大肠杆菌；c:产气肠杆菌；d:鼠伤寒沙门氏菌；e:金黄色葡萄球菌 图2

366nm紫外灯照射下

a:空白对照；b:大肠杆菌；c:产气肠杆菌；d:鼠伤寒沙门氏菌；e:金黄色葡萄球菌 图3

  4.1.2 结果报告

  根据大肠菌群阳性管数，通过查MPN表，报告每100mL(g)食品中大肠菌群MPN值。

  4.2 大肠菌群的菌落计数

  4.2.1 检验方法

  用灭菌吸管吸取待检样液1.0mL，加入无菌平皿内。每个样品接种三个连续稀释度，每个稀释度接种两个平皿。于每个加样平皿内倾注15mL 45～50℃的Aiiz-gal琼脂，迅速轻轻转动平皿，使混合均匀。待琼脂凝固后，再倾注3mL-5mL Aliz-gal琼脂覆盖表面。同时将Aliz-gal琼脂倾人加有1mL上述无菌磷酸盐缓冲液（或生理盐水）的无菌平皿内作空白对照。

  待琼脂凝固后，翻转平板，于37±1℃培养箱培养18h-24h。取出平板，计数紫色（或红色）菌落。

  培养基检验原理：胰酪胨提供碳氮源、维生素和矿物质满足细菌生长的需求；氯化钠可维持均衡的渗透压；磷酸二氢钾和磷酸氢二钾是培养基pH缓冲剂；月桂基硫酸钠可抑制革兰氏阳性菌的生长；大肠菌群可产生β-半乳糖苷酶，分解液体培养基中的酶底物茜素-β-D-半乳糖苷（Aliz-gal），使茜素游离并与固体培养基中的铝、钾、铁、钱离子结合形成紫色（或红色）的鳌合物，使菌落呈现相应的颜色。

  培养基用法：称取本品46.7g，加热溶解于1000mL蒸馏水中，116℃高压灭菌10分钟，备用。

  质控菌株接种到Aliz-gal琼脂中，培养结果如下图所示：

大肠杆菌ATCC 25922		弗氏柠檬酸杆菌ATCC 43568		鼠伤寒沙门氏菌ATCC 14028

图4 标准菌株在Aliz-gal琼脂中生长情况

  4.2.2 结果报告

  4.2.2.1 当平板上的紫色（或红色）菌落数不高于150个，且其中至少有一个平板紫色（(或红色）菌落不少于15个时，按公式1计算大肠菌群数：

  公式1：N=∑C/（n₁+n₂）d

  式中：

  N—样品的大肠菌群数，个/mL或g；

  ΣC—所有计数平板上，紫色（或红色）)菌落数之总和；

  n₁—供计数的最低稀释倍数的平板数；

  n₂—供计数的高一稀释倍数的平板数；

  d—供计数的样品最低稀释度（如10^-1，10^-2，10^-3等）。

  4.2.2.2 如接种所有（3个）稀释样品的平板上，紫色（或红色）菌落数均少于15个时，仍按式(1)计算，但应在所得结果旁加“*”号，表示为估计值。

  4.2.2.3 如接种未稀释样品和所有稀释样品的平板上，紫色（或红色）菌落数均少于15个时，报告结果为：每毫升（克）样品少于15个大肠菌群。

  4.2.2.4 如接种未稀释样品和所有稀释样品的平板上，均未发现紫色（或红色）菌落数时，报告结果为：每毫升（克）样品少于1个大肠菌群。

  4.2.2.5 如平板上的紫色（或红色）菌落数高于150个时，按式(1)计算，在结果旁加“*”号表示估计值或视情况重新选择较高的稀释倍数进行测定。

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