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中国药典版菌株鉴定验证方法、图谱及所用试剂列表

纪旭艳
录入时间:2021-8-2 12:01:33 来源:青岛海博生物


一、金黄色葡萄球菌 Staphylococcus aureus


金黄色葡萄球菌是—种自然界常见的条件致病菌,该菌为葡萄球菌属,革兰氏染色为阳性球菌,呈葡萄状排列。在TSA平板上为圆形、光滑、凸起菌落, 多数菌株有黄色色素, 菌落呈黄色,也有—些菌株呈乳白色;在血平板上通常呈β溶血, 也有部分菌株不表现溶血, 在甘露醇氯化钠琼脂上为黄色菌落,周围有黄色环。



金黄色葡萄球菌-血平板
金黄色葡萄球菌- 甘露醇氯化钠琼脂


鉴定方法:革兰氏染色+血浆凝固酶试验

(1) 革兰氏染色金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性球菌, 排列呈葡萄球状, 无芽胞, 无荚膜, 直径约为0.5μm-1μm 。

(2) 血浆凝固酶试验将待测菌接种至胰酪大豆脉液体培养基中过夜培养, 吸取0.2-0.3ml培养物加入至0.5ml兔血浆中, 36℃培养,每半小时观察—次结果, 观察至6h, 完全凝固或凝固体积大于—半即为血浆凝固酶试验阳性。金黄色葡萄球菌血浆凝固酶试验为阳性。



金黄色葡萄球菌染色镜检





血浆凝固酶试验


注:2010版中国药典中使用营养肉汤进行过夜培养或直接挑取菌落至0.9%氯化钠溶液中制成菌悬液,吸取0.5ml培养物至0.5ml兔血浆中,食品国标中使用BHI 进行过夜培养,吸取0.2-0.3ml培养物至0.5ml兔血浆中。以上方法均可使用,不影响最终鉴定结果。

革兰氏染色操作视频:http://www.hopebiol.com/video/gelanshiranse.asp

血浆凝固酶实验操作视频:http://www.hopebiol.com/video/xuejiangninggu.asp


参考资料:

《中国药典》2010年版第二部

《GB4789.10-2016 食品微生物学检验金黄色葡萄球菌检验》


二、大肠埃希氏菌 Escherichia coli


大肠埃希氏菌广泛存在千人和温血动物的肠道中, 能够在44.5 °C 发酵乳糖产酸产气, IMViC (靛基质、甲基红、VP 试验、柠檬酸盐) 生化试验为+ + - -或- + - -的革兰氏阴性杆菌。在麦康凯平板上由于强烈发酵乳糖产酸,菌落呈桃红色, 菌落周围有沉淀环。


鉴定方法1 (推荐) :革兰氏染色+ IMViC试验+乳糖发酵试验

(1) 革兰氏染色大肠埃希氏菌为革兰氏阴性无芽孢杆菌。

(2) IMViC试验即靛基质试验、甲基红试验(MR) 、V-P试验、柠檬酸盐利用试验, 挑取待测菌落至无菌生理盐水中制成菌悬液,加入至大肠埃希氏菌鉴定条中培养24-48h , 培养结束后, 滴加对应的试剂,观察记录结果。多数大肠埃希氏菌反应为++-- , 少数大肠埃希氏菌反应为-+-- 。

靛基质试验:培养结束后,滴加1-2滴靛基质试剂出现玫红色环为阳性,黄色环为阴性。

甲基红试验(MR): 培养结束后,滴加数滴甲基红试剂显红色为阳性, 橙黄色为阴性。

V-P试验:培养结束后,滴加VP试剂A液与B液, 继续培养不超过4h, 出现变红为试验阳性,不变红或橙黄色为阴性。

柠檬酸盐利用试验:培养结束后,观察培养基颜色变化,若由绿色变为蓝色为阳性反应,不变色为阴性反应。

(3) 乳糖发酵试验挑取待测菌落接种至乳糖发酵培养基中, 44.5℃ 培养24-48h , 大肠埃希氏菌可产酸变黄, 产气。




大肠埃希氏菌-麦康凯琼脂平板
大肠埃希氏菌染色镜检
乳糖发酵试验

IMViC试验

注:乳糖发酵试验也可选用EC肉汤、乳糖胆盐发酵培养基、乳糖蛋白胨培养基等, 在麦康凯液体培养基中也可观察到大肠埃希氏菌产酸产气现象。


鉴定方法2: 使用博检革兰氏阴性菌鉴定系统

挑取待测菌落至无菌生理盐水中制成约10⁹CFU/ml 的菌悬液, 接种至革兰氏阴性菌鉴定条中36 °C 培养18-24h , 观察记录结果输入博检数据库系统可查询鉴定结果。


鉴定方法3 (2010版中国药典鉴定方法):

挑取待测菌接种至MUG培养基36°C培养5-24h ,继续滴加靛基质试剂观察靛基质反应。

若靛基质与MUG 同为阳性反应, 则可确认为大肠埃希氏菌。


MUG培养基的使用方法视频:http://www.hopebiol.com/video/mugpeiyangji.asp


若MUG阳性, 靛基质阴性,需将待测菌接种至曙红亚甲基蓝琼脂平板(EMB) 或麦康凯琼脂平板进行下—步判断。大肠埃希氏菌在EMB平板上通常为紫黑色菌落, 常有金属光泽, 在麦康凯琼脂上通常为桃红色菌落。


大肠埃希氏菌- EMB平板


参考资料:

《GB4789.38-2012 食品微生物学检验大肠埃希氏菌计数》

《中国药典》2010年版第二部


三、沙门氏菌 Salmonella


沙门氏菌是—种常见的肠道致病菌,为革兰氏阴性杆菌。该菌由于菌型较多,在选择性平板上有多种形态,生化反应也有多个生化群, 在鉴定上要比其他菌复杂—些。大多数沙门氏菌不发酵乳糖和蔗糖,产硫化氢, 在木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂(XLD) 平板上呈无色至淡红色透明菌落,有黑色中心,少数不产硫化氢的沙门氏菌在XLD 平板上菌落无黑色中心。极少数的乳糖发酵型沙门氏菌在XLD平板上为黄色菌落,有或无黑色中心。



XLD平板上菌落形态
沙门氏菌染色镜检

鉴定方法1 :三糖铁+沙门氏菌生化鉴定条

由于沙门氏菌生化群较多, 参考食品标准, 主要可分为以下几种结果

(1) 典型沙门氏菌反应三糖铁反应为K/A (斜面产碱红色,底层产酸黄色),硫化氢阳性(底层变黑),沙门氏菌生化鉴定条中前四项反应分别为靛基质-,尿素酶-, KCN- ,赖氨酸脱羧酶+,此时可判断为典型沙门氏菌。标准菌株通常为此种反应类型(如乙型副伤寒沙门菌) 。极少数沙门氏菌在三糖铁上反应为A/A (斜面底层均为黄色),硫化氢阳性。

(2) 靛基质阳性变体沙门氏菌与(1) 典型沙门氏菌反应相比,唯—不同的是靛基质反应为阳性。此时需继续观察鉴定条中的甘露醇和山梨醇反应,若此两项反应均为阳性,结合血清学试验进行判断。

(3) 个别变体尿素酶阳性沙门氏菌与(1) 典型沙门氏菌反应相比, 唯—不同的是尿素酶反应为阳性。此种沙门氏菌极其罕见, 此时需做血清试验进行判断。

(4) KCN 阳性沙门氏菌与(1) 典型沙门氏菌反应相比, 唯—不同的是KCN 反应为阳性。此时需继续观察鉴定条中的水杨昔、山梨醇、丙二酸盐、ONPG 和卫矛醇反应,是否符合沙门氏菌生化群IV或V (生化群IV反应为水杨昔+、山梨醇+、丙二酸盐-、ONPG- 、卫矛醇-,生化群V反应为水杨甘-、山梨醇+、丙二酸盐-、ONPG+ 、卫矛醇+) 。

(5) 不产硫化氢沙门氏菌与(1) 典型沙门氏菌反应相比,三糖铁反应为K/A, 底层不变黑。此时需补做ONPG 试验,若ONPG 为阴性, 也为沙门氏菌。若赖氨酸为阴性, 则有可能为甲型副伤寒沙门菌, 需做血清试验。


三糖铁试验

鉴定方法2: 博检革兰氏阴性细菌鉴定系统

挑取待测菌落至无菌生理盐水中制成约10⁹CFU /ml 的菌悬液,接种至革兰氏阴性菌鉴定条中36℃培养18-24h , 观察记录结果, 输入博检数据库系统可查询鉴定结果。


参考资料《GB4789.4-2016 食品微生物学检验沙门氏菌检验》



四、铜绿假单胞菌 Pseudomonas aeruginosa


铜绿假单胞菌为非发酵革兰氏阴性杆菌, 专性需氧在自然界中广泛存在, 大多数菌株可产生水溶性荧光素及绿脓菌素。在淏化十六院基三甲桉琼脂平板上菌落呈绿色, 在366nm 波长紫外灯下观察可见荧光。

铜绿假单胞菌-溴化十六烷三甲基琼脂平板

铜绿假单胞菌镜检图片

鉴定方法:

(1) 革兰氏染色为阴性杆菌。

(2) 氧化酶试验:将氧化酶试纸用蒸馏水浸湿,用细玻璃棒或—次性接种针挑取单个菌落,涂在试纸上,30s内变为蓝色或蓝紫色为阳性反应。铜绿假单胞菌氧化酶试验为阳性。

(3) 绿脓菌素试验:挑取待测菌落接种在绿脓菌素测定用培养基(PDP) 斜面上,培养24小时,观察斜面有无色素。如有色素, 在试管内加氯仿3.0 - 5.0ml, 充分震摇,使培养物中的绿脓菌素提取在氯仿中,待氯仿提取液呈现绿色时, 加1mol/L盐酸约1ml , 震摇后静置片刻上层盐酸溶液中呈现粉红至红色实验结果为阳性,否则为阴性。大多数铜绿假单胞菌绿脓菌素试验为阳性。


氧化酶试验


绿脓菌素试验


氧化酶实验操作视频:http://www.hopebiol.com/video/yanghuamei.asp

绿脓菌素测定(PDP)试验操作视频:http://www.hopebiol.com/video/lvnongjunsu.asp

注:革兰氏染色阴性杆菌+氧化酶试验阳性+绿脓菌素试验阳性可以确证大多数的铜绿假单胞菌。若绿脓菌素试验为阴性,则需补充荧光试验和乙酰胺产氨试验, 荧光试验和乙酰胺产氨均为阳性, 也可判定为铜绿假单胞菌。

(4) 荧光试验:挑取待测菌接种于金氏B培养基上,于36 °C 士1 °C 恒温箱培养24h 5d 。每天需取出在366nm波长紫外光下观察是否有荧光。

(5) 产氨试验:挑取待测菌接种到乙酰胺肉汤,在36土1 °C 下培养20h-24h 。

立即观察结果, 若出现深黄色到砖红色的沉淀, 则为阳性结果, 否则为阴性。

荧光试验

产氨试验

乙酰胺肉汤实验操作视频:http://www.hopebiol.com/video/yixianan.asp


五、枯草芽孢杆菌 Bacillus subtilis


枯草芽孢杆菌为革兰氏阳性芽孢杆菌,在TSA上菌落表面粗糙不透明,有褶皱,菌落较大, 呈不规则状, 在7 %氯化钠中生长, V-P测定阳性,硝酸盐还原阳性,分解D-甘露醇产酸,不利用丙酸盐。

枯草芽孢杆菌-TSA平板

枯草芽孢杆菌染色镜检

鉴定方法:

(1) 革兰氏染色为阳性杆菌。

(2) 在硫酸锰营养琼脂上培养5-7天,进行芽孢染色,可观察到椭圆形或卵圆形芽孢。

(3) 生化试验做7%氯化钠生长试验、V-P试验、硝酸盐还原试验、D -甘露醇发酵试验和丙酸盐利用试验。

7%氯化钠生长试验:挑取待测菌落接种至7%氯化钠生长管中, 36℃培养2-7天,浑浊生长为阳性, 不生长为阴性。枯草芽抱杆菌为阳性反应。

V-P试验:挑取待测菌落接种至V-P 生化管中, 36 士1 °C 培养2-4天,滴加V-P试剂A液与B液后, 继续培养不超过4h,出现红色反应为阳性,不变色或橙黄色为阴性。枯草芽孢杆菌V-P 为阳性反应。

硝酸盐还原试验:挑取待测菌落接种至硝酸盐还原肉汤中, 36℃培养2-4天,滴加硝酸盐还原试剂A液与B液数分钟后,若出现变红,则为硝酸盐还原阳性反应。若不变红,需继续加入锌粉或锌粒,若仍不变红,也为阳性反应。若加入锌粒后变红, 则为硝酸盐还原阴性反应。枯草芽孢杆菌硝酸盐还原反应阳性。

D-甘露醇发酵试验:挑取待测菌落接种至D-甘露醇发酵管中, 36 士1℃ 培养2-5 天, 若出现变黄, 则为阳性反应,不变色为阴性反应。枯草芽孢杆菌为阳性反应。

丙酸盐利用试验:挑取待测菌落接种至丙酸盐培养基中, 36 士1℃ 培养48h, 若培养基变为蓝色,则为阳性反应,不变色为阴性反应。枯草芽孢杆菌不利用丙酸盐,为阴性反应。





7%氯化钠生长试验
V-P试验 硝酸盐还原试验
D-甘露醇发酵试验


注:也可使用芽孢鉴定条进行鉴定,芽孢鉴定条包括厌氧生长试验、V-P反应、柠檬酸盐利用试验、丙酸盐利用试验、硝酸盐还原试验、淀粉水解试验、7%氯化钠生长试验、明胶液化试验、pH5.7生长试验、L 阿拉伯糖发酵试验、D-甘露醇发酵试验、D-木糖发酵试验,除鉴定枯草芽孢杆菌外, 也可鉴定常见的地衣芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、蜡样芽胞杆菌、巨大芽孢杆菌等。


参考资料:《GBT26428-2010 饲用微生物制剂中枯草芽孢杆菌的检测》




六、梭菌 Clostridium


梭菌是—群革兰阳性杆菌, 专性厌氧,能产生芽抱,芽抱在菌体内膨大, 使菌体呈梭形或鼓梯形。大多数为非致病菌,少数为致病菌, 常见的致病菌有产气荚膜梭菌、肉毒梭菌、破伤风梭菌、艰难梭菌等。该菌属对庆大霉素不敏感, 因此常用含庆大霉素的哥伦比亚琼脂进行分离培养。

鉴定方法:

梭菌属的种类较多, 多数生化反应不—致,可使用染色+过氧化氢酶试验+ PCR方法鉴定。梭菌革兰氏染色为阳性杆菌, 过氧化氢酶阴性,若此两项特征符合,可继续通过PCR方法进—步鉴定是否为梭菌。

过氧化氢酶试验:用塑料接种环挑取菌落至3 %过氧化氢中(或将3 %过氧化氢滴加至菌落上) , 观察是否有气泡产生, 产生大量气泡为过氧化氢酶阳性。梭菌属过氧化氢酶反应为阴性, 不产生气泡。(注:不可使用铁制品挑取菌落,不可使用血平板培养物)


过氧化氢酶试验

过氧化氢酶实验操作视频:http://www.hopebiol.com/video/guoyanghuaqingmei.asp

参考资料:《中国药典》2015年版第四部



七、白色念珠菌 Candida albicans


白色念珠菌又叫白色假丝酵母菌, 是—种双相真菌。在培养基上通常表现为酵母相, 在沙氏葡萄糖琼脂上为白色圆形光滑凸起菌落,有酵母味革兰氏染色呈圆形或卵圆形,在念珠菌显色培养基上呈翠绿色圆形凸起菌落。致病时通常表现为菌丝相, 菌体出芽产生芽管和假菌丝。

白色念珠菌- SDA平板

白色念珠菌染色镜检

鉴定方法:

(1) 革兰氏染色为阳性球形或卵圆形菌,比金黄色葡萄球菌大5-6倍,有时可见菌体之间有假菌丝。

(2) 念珠菌显色培养基呈翠绿色圆形凸起菌落。

(3) 芽管试验:将待测菌接种至1 %吐温80 -玉米琼脂培养基培养24-48h, 挑取少许培养物接种千加有—滴血清的在玻片上, 盖上盖玻片, 置湿润的平皿内, 35-37°C 培养1-3 小时, 置显微镜下观察是否有芽管产生。白色念珠菌可产生芽管结构。

白色念珠菌- 念珠菌显色平板

芽管试验

参考资料:《中国药典》2010 年版第二部



八、黑曲霉 Aspergillus niger


霉菌的鉴定常通过平板上的菌落形态及低倍显微镜下的菌丝形态观察进行菌属的判断。黑曲霉在沙氏葡萄糖琼脂上20-25℃培养48-120h , 逐日观察, 初期可观察到产生白色菌丝, 呈辐射状生长, 菌丝老化后逐渐变为黄褐色, 菌丝顶部产生黑色孢子。

乳酸酚棉蓝染色镜检用接种钩挑取菌丝及抱子(或直接挑取小块培养基)至载玻片, 滴加数滴乳酸酚棉蓝染色液,盖上盖玻片, 在低倍镜下观察结构。黑曲霉产孢结构顶囊为接近球形, 周围环绕黑色孢子,孢子呈圆形或椭圆形。

黑曲霉菌- SDA平板

黑曲霉-乳酸酚棉蓝染色

参考资料《GB4789 .16-2016 食品微生物学检验常见产毒霉菌的形态学鉴定》



所需试剂列(点击产品名称即可查看产品详情)


产品货号 产品名称 规格 价格

金黄色葡萄球 Staphylococcus aureus

鉴定方法:冻干菌种复苏接种至TSA平板,革兰氏染色镜检及血浆凝固酶试验。

HBPM034-7 胰酪大豆胨琼脂培养基平板(9cm)
9cm*10个/包
60
HB8278 革兰氏染色液试剂盒
5ml*8
40
HBPT4114-19-1 胰酪大豆胨液体培养基管
10ml*20支/盒
160
HB4117-4 冻干兔血浆
0.5ml*10
75

大肠埃希氏菌 Escherichia coli

鉴定方法:冻干菌种复苏接种至TSA平板,革兰氏染色镜检及IMViC生化试验或博检革兰氏阴性细菌鉴定系统生化检测。

HBPM034-7
胰酪大豆胨琼脂培养基平板(9cm)
9cm*10个/包
60
HB8278
革兰氏染色液试剂盒
5ml*8
40
HBPT8420 乳糖发酵培养基管
10ml*20支/盒
200
HBIG13 HBI大肠杆菌生化鉴定条
5条/盒
100
HB8679 博检革兰氏阴性细菌鉴定系统
5条/套
300
HB8280 甲基红试剂盒
5ml*2
20
HB8281 V-P试剂盒
5ml*4
20
HB8279 Kovacs氏靛基质试剂盒
5ml*2
20
GS070 无菌液体石蜡
1.7ml*20
20
乙型副伤寒沙门氏菌 Salmonella paratyphi B
鉴定方法:冻干菌种复苏接种至TSA平板,三糖铁试验、革兰氏染色镜检及接种至沙门氏菌生化鉴定条或博检革兰氏阴性细菌鉴定系统生化检测。
HBPM034-7
胰酪大豆胨琼脂培养基平板(9cm)
9cm*10个/包
60
HB8278
革兰氏染色液试剂盒
5ml*8
40
HBPT008-5 三糖铁琼脂培养基管(中国药典)
20支/盒
160
HBIG01 HBI沙门氏菌生化鉴定条(GB)
5条/盒
175
HB8679 博检革兰氏阴性细菌鉴定系统
5条/套
300
HB8281 V-P试剂盒
5ml*4
20
HB8279 Kovacs氏靛基质试剂盒
5ml*2
20
GS070 无菌液体石蜡
1.7ml*20
20

铜绿假单胞菌 Pseudomonas aeruginosa

鉴定方法:冻干菌种复苏接种至TSA平板,革兰氏染色镜检、氧化酶实验、绿脓菌素测定试验、荧光试验及乙酰胺产氨试验。

HBPM034-7
胰酪大豆胨琼脂培养基平板(9cm)
9cm*10个/包
60
HB8278
革兰氏染色液试剂盒
5ml*8
40
HB2100 氧化酶试纸
10片
25
HBPT5187 绿脓菌素测定培养基管(PDP)13ml
20支/盒
160
HBPT8484-1 金氏B培养基管
5ml*20支/盒
160
HB8653 乙酰胺肉汤生化管
20支
40
HB8654 钠氏试剂
5ml*2
60
枯草芽孢杆菌 Bacillus subtilis
鉴定方法:冻干菌种复苏接种至TSA平板,革兰氏染色及芽抱染色镜检。并做7%氯化钠生长试验、VP试验、硝酸盐还原试验、D -甘露酵发酵试验、丙酸盐利用试验。
HBPM034-7 胰酪大豆胨琼脂培养基平板(9cm)
9cm*10个/包
60
HB8278 革兰氏染色液试剂盒
5ml*8
40
HB8300-2 芽孢染色液
5ml*4
40
HBPM4177-1 硫酸锰营养琼脂平板
10个/包
80
GB181 7%氯化钠生长生化管(枯草芽孢杆菌)
20支/盒
35
GS003 MR-VP
20支
30
HB8281
V-P试剂盒
5ml*4
20
GB182
硝酸盐还原(枯草芽孢杆菌)
20支/盒
35
HB8282
硝酸盐还原试剂盒
5ml*4
20
GB179
D-甘露醇发酵管(枯草芽孢杆菌)
20支
25
GB180
丙酸盐(枯草芽孢杆菌)
20支
60
HBIG14
HBI芽孢杆菌生化鉴定条
5条/盒
200
HB8282
硝酸盐还原试剂盒
5ml*4
20
HB8281
V-P试剂盒
5ml*4
20
HB9139
卢戈氏碘液
5ml*4支
40
白色念珠菌 Candida albicans
鉴定方法: 冻干菌种复苏后接种至SDA平板上,划线接种千念珠菌显色平板,革兰氏染色镜检及产芽管试验。
HBPM0253-8
沙氏葡萄糖琼脂平板
9cm*10个
70
HB8278
革兰氏染色液试剂盒
5ml*8
40
HB7015
念珠菌显色培养基
1000ml
750
HB0236-1
1%吐温80-玉米琼脂培养基
250g
250
黑曲霉 Aspergillus niger
鉴定方法:冻干菌种复苏后接种至SDA平板上,培养至产丰富抱子,镜检观察菌丝及抱子形态。
HBPM0253-8
沙氏葡萄糖琼脂平板
9cm*10个
70
HB8296
乳酸酚棉蓝染色液
5ml*8
40
生孢梭菌 Clostridium sporogenes
鉴定方法:冻干菌种复苏接种至硫乙醇酸盐流体培养基中,划线至哥伦比亚琼脂平板并做革兰氏染色、过氧化氢酶试验
HB5190-5
硫乙醇酸盐流体培养基(中国药典)
250g
115
HB8278
革兰氏染色液试剂盒
5ml*8
40
HB0124-1
哥伦比亚琼脂培养基(中国药典)
250g
235
HB0124-1a
硫酸庆大霉素
1ml*5支
40
HBPM0124-1
哥伦比亚琼脂平板
9cm*10个/包
80
HB8650
3%过氧化氢酶试剂
20支
20

注:本文属海博生物原创,未经允许不得转载。

 

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