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饮用天然矿泉水:粪链球菌检验方法及结果分析

张辉
录入时间:2021-9-1 14:53:10 来源:青岛海博生物

一、大肠菌群简介:
  粪肠球菌根据最新分类原则又叫粪肠球菌。应用C多糖抗原,根据兰氏(Lancefield)血清学分类,可将链球菌分成许多群。粪链球菌属于D群。
  粪肠球菌(Enterococcus faecalis)是革兰氏阳性,过氧化氢阴性球菌,是人和动物肠道内主要菌群之一,其能产生天然抗生素,有利于机体健康;同时还能产生细菌素等抑菌物质,抑制大肠杆菌和沙门氏菌等病原菌的生长,改善肠道微环境;还能抑制肠道内产尿素酶细菌和腐败菌的繁殖,减少肠道尿素酶和内毒素的含量,使血液中氨和内毒素的含量下降。

  粪肠球菌作为一种益生菌,在医学和食品工程领域得到广泛应用。另外,肠球菌为消化道内正常存在的一类微生物,在肠黏膜具有较强的耐受和定植能力,并且是一种兼性厌氧的乳酸菌,与厌氧、培养保存条件苛刻的双歧杆菌相比,更适合于生产和应用。


二、参考标准:

  《GB8538-2016 饮用天然矿泉水:粪链球菌检验》


三、检验原理:

  采用滤膜法,将250mL水样用孔径为0.45μm的滤膜过滤,并将滤膜移至KF链球菌琼脂培养基上,于36℃±1℃恒温箱中培养48h,如果有红色或粉红色菌落生长,需将菌落接种于脑-心浸萃琼脂培养基上做进一步的确证试验,如过氧化氢酶反应为阴性,并能在脑-心浸萃琼脂培养基上于45℃培养后生成菌落,则证实粪链球菌的存在,其检测结果为阳性。


四、检验方法以及结果分析:

  粪链球菌检验程序见图1。


 图1 粪链球菌检验程序


4.1 推测性检验:
  4.1.1 水样过滤:
  应根据水质污染情况确定水样的稀释倍数,以滤过一张无菌滤膜后能产生20~100个菌落为宜,每张滤膜过滤250mL水样或稀释液。
  在100级的洁净工作台进行过滤操作。首先用无菌镊子夹取灭菌滤膜边缘部分,将粗糙面向上,贴放在已灭菌的滤床上,固定好滤器,滤膜经过滤后应直接转移到KF链球菌琼脂培养基上,同时避免在滤膜和培养基之间夹留着气泡。
  KF链球菌琼脂原理:䏡胨和酵母粉提供氮源、维生素和生长因子;麦芽糖和乳糖为可发酵糖类;氯化钠维持均衡的渗透压;叠氮化钠可抑制革兰氏阴性菌;琼脂是培养基的凝固剂;溴甲酚紫为指示剂染料;粪链球菌能将氯化三苯基四氮唑还原成一种酸性的偶氮染料,显示为深红色菌落。

  使用方法:称取本品69.4g,加热溶解于1000mL蒸馏水中,煮沸至完全溶解,冷却至50-60℃时,加入无菌1% TTC溶液10mL,混匀,倾入无菌平皿,备用。

  4.1.2 培养:

  将培养皿倒置,在36℃±1℃培养48h。

  4.1.3 计数:

  粪链球菌菌落在滤膜上呈现大小不等的红色或粉红色菌落。挑取不少于5个(不足5个则全挑)可疑菌落,进行革兰氏染色。镜检观察,粪链球菌应为革兰氏染色阳性球菌,常排列成短链状。根据菌落特征符合情况计数每250mL水样中的典型菌落数。

  粪链球菌接种到KF链球菌琼脂平板,培养结果如下图所示:


 图2 粪链球菌在KF链球菌琼脂平板上的菌落特征

4.2 确证性试验:
  4.2.1 从滤膜上挑取典型的菌落,接种到脑-心浸萃琼脂培养基斜面上,在36℃±1℃培养24h~48h。如果有菌落生长,则继续按4.2.2和4.2.3的步骤进行。

  粪链球菌接种到脑-心浸萃琼脂培养基斜面,培养结果如下图所示:


 图3 粪链球菌在脑-心浸萃琼脂培养基斜面上的生长情况

A:粪链球菌;B:空白对照;

  4.2.2 用接种环从脑-心浸萃琼脂培养基斜面上挑取典型培养物到一片清洁的载玻片上,加几滴新鲜配制的3%过氧化氢到载玻片的涂抹菌苔上,如果没有气泡发生,则显示过氧化氢酶反应为阴性,则菌落可视为可疑粪链球菌,需继续如下的确信过程。如果有气泡发生,则过氧化氢酶反应为阳性,因此菌落不属于粪链球菌,确信试验到此即可停止。


图4 粪链球菌过氧化氢酶试验结果

A:金黄色葡萄球菌;B:粪链球菌;

  4.2.3 用接种环从脑-心浸萃琼脂培养基上转移一环培养物到脑-心浸萃液态培养基内,在45℃培养48 h。此外,也同时转移一环培养物到胆汁液态培养基中,在36℃±1℃培养3 d。胆汁液态培养基由40 mL无菌的100 g/L牛胆盐溶液加入60 mL无菌的脑-心浸萃液态培养基中配制而成。

  粪链球菌接种到脑-心浸萃液态培养基和胆汁液态培养基中,培养结果如下图所示:



图5 粪链球菌在脑-心浸萃液态培养基和胆汁液态培养基中的生长情况

左:脑-心浸萃液态培养基;右:胆汁液态培养基;

A:粪链球菌;B:空白对照;

  4.2.4 转移到上述培养基后,若能够生长繁殖,则结果表示为阳性,证实为粪链球菌。

4.3 结果与报告:

  根据上述典型菌落的计数(4.1.3)和确证性试验为阳性的结果(4.2),计算每250mL水样中的粪链球菌数量,结果以CFU/250mL计。


KF链球菌琼脂-产品详情

http://www.hopebiol.com/asphtml/product2953.htm


GB 8538-2016 饮用天然矿泉水检验方法 -标准下载

http://www.hopebiol.com/biaozhun-download.asp?id=78


注:本文属海博生物原创,未经允许不得转载。


 

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