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微生物检测中菌悬液不会制备,化验结果怎么能保证准确?



录入时间:2021-9-26 15:13:31 来源:LabPTP能力验证平台

一、操作流程

  这里以大家最常用的大肠埃希菌为例,其它菌种方法类似。

  1.菌种制备从菌种保藏管中吸取少量菌液,转接到新鲜的TSB中,于30℃-35℃培养箱中培养18-24小时。

  2.稀释取步骤1的培养物1mL,加入到9mL的pH7.0氯化钠蛋白质缓冲液中,进行倍比稀释。

  3.平板计数取稀释好的菌液,一般取3个稀释级,每个梯度取2mL,分别加入两块90cm的平皿中,每皿加入1mL菌液,倾注45℃左右的已经经过确定的TSA培养基,轻轻摇匀,静置,培养基凝固后,置30-35℃培养箱中倒置培养48小时。

  4.菌落计数将培养后的平板,置于菌落计数器下进行菌落计数,以确定哪个稀释级的浓度能够满足测试的要求。


二、注意事项

  1.菌种制备也可以使用TSA平板进行培养,如果转接的是冷冻保藏管中的菌,最好再转接一次,使用第二次转接的菌种。

  2.稀释取菌液的时候,需要先对菌液进行振荡或吹打混匀,方可吸取菌液。可以不用进行倍比稀释,只要能保证最后加入到测试样品中的菌的数量符合要求即可。

  3.平板计数:取菌液时同样需要先将试管中的菌液进行混匀。

  4.培养基菌落计数不建议逐日观察结果,因为平板中可能有凝集水, 逐日观察拿动平板,可能会导致水落到菌落上,菌跟着水流到下一个空白地方,导致结果不准确;另外如果是霉菌,因为有孢子,拿动也会导致孢子落到平板空白地方,影响结果。


三、事后思考

  1.菌液的作用

  菌悬液使用有时效性要求

  2020版《中国药典》和《欧洲药典》8.0版要求如果放置在室温,菌悬液必须在2小时内使用,如果放置在2-8℃保存,可以在24小时内使用。

  那么问题来了,菌悬液的菌的数量需要在48小时后才能确定,但是在24小时之内菌悬液必须使用,所以在不知道菌含量的情况下,样品测试需要做至少三个梯度。

  笔者之前在微生物实验室做了5次的菌悬液制备,为了保证实验的成功,每次都是要做三个梯度,虽然大多数都是同一个稀释级的含量符合要求,但是还是偶尔有另一个稀释级才符合要求的时候,所以笔者每次都乖乖的做三个梯度的测试,还好笔者那个时候依据的法规中,日常的无菌检查和控制菌检查中没有阳性对照的要求。

  这里说的三个梯度不是说只是计数,而是菌悬液实际运用的测试中也需要三个梯度,举个例子,某个无菌产品无菌检查中的阳性对照测试,需要做三个对照。当然,同样的产品方法适用性,培养基促生长测试也是如此。流程图如下:

  2.步骤的繁琐

  这个流程图中,还是省略了一些步骤,一句话带过的倍比稀释,做过的小伙伴们知道,这个说起来容易做起来难。

  另外在接收菌种和从冷冻保藏管中取出菌种来使用时,还需要进行相应的鉴定,所以不要觉得这个流程好冗长,其实已经是简单版的。

 

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