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常用菌种的传代与保存方法

王娟
录入时间:2021-9-27 13:50:04 来源:青岛海博生物

一、菌株概念及传代

  (1)标准菌株:直接从官方菌种保藏机构获得并至少定义到属或种的水平的菌株。通常默认为第0代菌株。

  (2)标准储备菌株:将标准菌株在实验室转接一代后得到的一套完全相同的独立菌株。通常为第1代或第2代菌株。

  (3)储备菌株:从标准储备菌株转接一代获得的培养物。通常为第2代或第3代菌株。

  (4)工作菌株:由标准储备菌株、 储备菌株或标准物质(经证明或未经证明) 转接一代获得的菌株。通常为第3-5代菌。

  传代:每一次的转接培养都是一次传代的过程,可以使用液体、固体或半固体培养基。

  注意事项:菌株传代只能由上往下传,储备菌株可以做为工作菌株使用,但工作菌株不能做为储备菌株使用。实验室使用的工作菌株一般不可超过第5代,除非标准方法中有明确要求,或实验室能够证明菌株相关特性没有改变。若在传代过程中出现明显变异,也不可继续使用。


二、菌种保存的基本原理

  使微生物的生命活动处于半永久性的休眠状态,也就是使微生物的新陈代谢作用限制在最低范围内。干燥、低温和隔绝空气是保证获得这种状态的主要措施。有针对性地创造干燥、低温和隔绝空气的外界条件,就是微生物菌种保藏的基本技术。


三、菌种保存的常用方法
  (1)斜面保存法
  操作方法:将营养琼脂(或其他适宜的琼脂培养基)加热煮沸溶解后分装至试管中,灭菌后摆长斜面凝固,挑取菌落“之”字形划线接种至培养基斜面,置于合适的条件中进行培养。培养结束后,置2-8℃冷藏保存(部分菌株会在4℃产生自溶,如铜绿假单胞菌。副溶血性弧菌等,可置室温保存)。
  此法为实验室和工厂菌种室常用的保藏法,操作简单,使用方便,但易变异,屡次传代会使微生物的代谢改变,而影响微生物的性状,污染杂菌的机会亦较多。霉菌、酵母菌、放线菌和芽孢菌一般保存2-4个月传代一次,细菌一般保存一个月传代一次。

斜面保存法

  (2)液体石蜡保存法
  操作方法:将营养琼脂(或其他适宜的琼脂培养基)加热煮沸溶解,分装至试管中灭菌后摆长斜面,或使用半固体培养基加热煮沸溶解后分装至小试管,灭菌后摆直立,挑取菌落“之”字形划线接种至培养基斜面或穿刺接种至半固体培养基管,置于合适的条件中进行培养。培养结束后,在培养基表面覆盖一层无菌液体石蜡,2-8℃冷藏保存。
  液体石蜡一方面可防止因培养基水分蒸发而引起菌种死亡,另一方面可阻止氧气进入,以减弱代谢作用。此法比斜面保存法的保存期限更长,霉菌、酵母菌、放线菌、芽孢菌可保存1-2年甚至更长时间,多数无芽孢菌也可保存到一年以上。
(3)甘油冻存保存法
  操作方法:挑取菌落至液体菌种保存管中(商品化的液体菌种保存管中已加入甘油,直接使用即可;若自行配制,可在冻存液中加入15%-50%比例的甘油,或将菌液与无菌甘油溶液混合),用移液枪吹打均匀,制成约109CFU/mL的菌悬液,置于超低温冰箱中或液氮罐中冷冻保存(霉菌可挑取孢子冻存,保存温度越低效果越好,长期保存建议在-70℃以下冻存)。
  该方法适用范围广,操作简便,效果好,无变异现象发生。-20℃保存时间较短,一般可保存一年左右,-70℃以下可保存较长时间,一般至少可保存两年以上,有些菌种甚至可保存十年以上。
  注意事项:反复冻融易导致菌株死亡,在中国药典中规定,融化后的菌种保存管不可再进行冷冻保存。
液体菌种保存管(含甘油)
  (4)真空冷冻干燥保存法
  通常以牛奶为载体,加入菌株制成菌悬液,使用真空冻干机器进行脱水冻干处理,制成冻干粉。相比较于其他保存方法,真空冷冻保存法更容易保存菌种的活力,延长保存时间,适用于98%以上菌种的保存,但操作复杂,一般实验室难以使用。
  (5)载体保存法
  以沙土、滤纸、硅胶等材料做为载体吸附菌株,通过五氧化二磷干燥保藏的方法。保藏时间长,应用较为广泛,但一般实验室通常不易操作。
  (6)瓷珠保存法
  瓷珠菌种保存管是实验室保存菌种的容器,管内有表面凹孔小瓷珠用于细菌的吸附和保存,甘油做为抗冻保护剂可减少冷冻过程中形成的冰晶,瓷珠菌种保存管放置于-20℃或-80℃下便可创造干燥、低温、缺营养的环境,使菌株处于“休眠” 状态,方可长期保存(视不同菌种与保存温度,一般可保存3-10 年),同时菌种保存管的取用和保存较为便利(取用复苏及保存菌株仅需1 分钟)。
  保存方法:挑取平板或斜面上的新鲜纯培养物于菌种保存管中,配成大约3-4麦氏比浊度的菌悬液,盖上盖子来回颠倒几次使细菌乳化,用无菌移液器将菌种保存管内的液体吸取干净,仅留下瓷珠,拧紧保存管,迅速将其置于-20℃或-70℃冰箱中。
  使用方法:无菌条件下,用灭过菌的针或者镊子取出一个小瓷珠,将小瓷珠直接用作平板划线或加到合适的液体培养基中,置合适的条件下进行培养即可。
瓷珠菌种保存管


四、实验室常用菌种的保存方法

  (1)短期、中期保存:葡萄球菌、沙门氏菌、埃希氏菌、志贺氏菌、假单胞菌、假单胞菌、李斯特氏菌等,可使用营养琼脂斜面或TSA斜面4℃保存(铜绿假单胞菌在4℃会出现自溶,可以置室温保存),通常可保存1-3个月。白色念珠菌、酵母菌、霉菌等可使用沙氏葡萄糖琼脂斜面4℃保存,通常可保存3-6个月。生孢梭菌、产气荚膜梭菌可使用疱肉培养基培养后置4℃保存,可存活数月至1年以上。
  (2)长期保存:对于大多数的细菌、真菌,普通实验室都可以选用瓷珠保存法或甘油保存法置-20℃以下或-70℃以下冻存,温度越低保存时间越长。(注:保存霉菌时挑取孢子冻存即可;保存厌氧菌建议使用甘油保存法,避免反复冻融;使用甘油冻存法保存弯曲杆菌、螺杆菌、嗜血杆菌等细菌时,加入5%-10%比例的脱纤维羊血效果更佳)。


注:本文属海博生物原创,未经允许不得转载。


 

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