专性厌氧菌的培养方法及注意事项

一、专性厌氧菌的介绍

  根据细菌生长对氧的需求，主要可分为四大类：专性需氧菌、兼性厌氧菌、专性厌氧菌、微需氧菌。

  专性厌氧菌需要在严格无氧的气体环境中生长，氧气会对菌产生毒害作用，也有一些厌氧菌在含5%-10%二氧化碳气体环境中可耐受低浓度的氧气。常见的专性厌氧菌有梭菌属（如产气荚膜梭菌、肉毒梭菌、破伤风梭菌、艰难梭菌等）、双歧杆菌属（如婴儿双歧杆菌、动物双歧杆菌等）、拟杆菌属、梭杆菌属、厌氧消化链球菌属等。

二、厌氧培养环境的构造

  （1）使用厌氧培养箱，通气培养。一些厌氧培养箱可同时进行接种等微生物操作，并直接进行培养，操作方便，成功率高，缺点是多数实验室不具备，损耗较大，对于小规模的培养试验来说，成本较高。

  （2）使用厌氧罐、厌氧盒或厌氧培养袋+厌氧产气包，可制作小型或中型空间的厌氧环境，操作方便，不需要任何复杂的专门设备，可在所有实验室中使用，非常适合实验室中小规模的试验操作。

注意事项：培养基必须与厌氧环境气体流通，如使用试管、锥形瓶等容器培养，必须确保塞子透气；培养平皿时，必须保证平皿的透气性良好，不能使用封口膜密闭缠绕。

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  （3）液体培养基可采用覆盖石蜡隔绝氧气的方法，如疱肉培养基、梭菌增菌培养基等，在培养基配制完成分装后，在培养基上方覆盖约0.5-1cm厚度的液体石蜡，再进行灭菌处理，可直接进行厌氧菌的培养，无需使用厌氧培养箱或厌氧罐等设备。

  注：在灭菌前覆盖石蜡，灭菌过程中培养基中溶解的氧气会逸出，冷却后石蜡会阻隔空气中氧气的进入，可以更好的制造厌氧环境；培养基中也可补加一定量的还原性铁粉或硫乙醇酸钠、半胱氨酸等还原性成分，帮助维持厌氧环境。

  （4）有些培养基可自然的形成厌氧环境，无需厌氧培养，如硫乙醇酸盐流体培养基，静置过程会自发分层，下层为无氧环境，无需任何厌氧设备，也无需覆盖液体石蜡，即可培养厌氧菌。

三、常见厌氧菌的培养基

1.硫乙醇酸盐流体培养基

  此培养基常用于梭菌的活化及增菌培养，也可对营养成分进行改良用于一些营养要求较高的厌氧菌的培养，此培养基可自然的形成厌氧环境，无需厌氧培养，此培养基静置过程会自发分层，下层为无氧环境，无需任何厌氧设备，也无需覆盖液体石蜡，即可培养厌氧菌。

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2.疱肉培养基

  相比较于硫乙醇酸盐流体培养基，此培养基需覆盖液体石蜡，用于培养梭菌时，可以存活更长时间（如生孢梭菌，在硫乙醇酸盐流体培养基中只能存活数天，而在疱肉培养基中可存活数月以上）。

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3.GAM/改良GAM培养基

  此培养基营养非常丰富，适用于绝大多数的厌氧菌培养，特别是用于比较难培养的营养苛求型细菌（如拟杆菌属）。

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4.血平板/CDC厌氧菌琼脂

  营养丰富，适用于绝大多数厌氧菌的培养（梭菌、拟杆菌等均可培养）。

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5.MRS琼脂/肉汤

  用于双歧杆菌的培养，制备好的MRS肉汤培养基澄清透明无沉淀，常用于乳酸菌或双歧杆菌的活化、增菌及收集菌体。

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四、注意事项

  （1）培养基的制备

  需覆盖石蜡的液体培养基，应在灭菌前完成分装并覆盖液体石蜡；流体培养基或半固体培养基在有氧条件下培养厌氧菌时，使用前可采用沸水浴或其他除氧方式排出培养基内溶解的氧气.

  （2）操作过程

  因氧气会对厌氧菌产生毒害作用，因此整个操作过程应在专门的无氧设备中进行。如在正常空气中操作，从厌氧菌暴露在空气中开始到放入厌氧环境中培养结束，整个过程应尽可能快速操作，一般不超过15分钟，暴露时间越长，厌氧菌越容易死亡。

  （3）培养环境

  可采用厌氧罐、厌氧培养箱、厌氧产气包等方式提供厌氧环境，除了确保气体环境无氧之外，有些厌氧菌通常还需要5%-10%的二氧化碳、氢气等气体促进生长并提高厌氧菌对氧气的耐受性，更容易培养成功。

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