博检革兰氏阴性细菌鉴定系统原理及使用方法

一、产品介绍：
  本系统由青岛高科园海博生物技术有限公司联合山东省出入境检验检疫局共同研发设计，筛选21项生化反应，历经两年多的不断改良，现可鉴定一百多种常见革兰氏阴性细菌，鉴定结果接近100%，可广泛用于革兰氏阴性细菌的快速鉴定。

二、使用方法：
  1、挑取新培养的待检测菌单菌落于9mL生理盐水中制成菌悬液，用酒精棉擦拭打孔器和盖子消毒，将生化鉴定条打孔后，每孔接种100μL菌液，氨基酸需覆盖约300μL无菌石蜡，盖上盖子至于37℃培养24h后，观察实验结果。
  2、滴加1-2滴无菌水将氧化酶试纸润湿，使用玻璃棒挑去新鲜菌落涂抹于氧化酶试纸，观察试验结果。
  3、每三孔记为1组，共7组（氧化酶为最后一位），第一孔若阳性记为1，第二孔若阳性记为2，第三孔若阳性记为4，若为阴性则记为0，将每组三孔数值相加，便可得到7个数组成的编码，将此编码输入数据库（如有反应不确定可在前面打对号），读取鉴定结果。

三、原理及结果判断：
  不同种属的细菌具有不完全相同的生化特征。本系统选取21种典型生化试验（20孔生化鉴定条和一个氧化酶试纸），并把生化反应的结果转换为一个8进制数，通过提供的标准数据库查询系统可得到实验菌株归属的相对概率、T值和R值，对菌株的归属进行一定程度的鉴定。
  1孔为ONPG试验，有些细菌有β-半乳糖苷酶，可水解ONPG，释放出黄色的邻位硝基苯酚，因此溶液变黄为阳性反应，无色为阴性反应。
  注意事项：ONPG反应较快，接种菌量大时数小时即可获得阳性结果，该试验亦可鉴别迟缓发酵乳糖和不发酵乳糖细菌，如宋内志贺氏菌迟缓发酵乳糖变黄，ONPG可24h内阳性。

乳糖发酵管	ONPG

  2、3、4孔分别为精氨酸、赖氨酸和鸟氨酸脱羧酶试验，有些细菌可产生某种氨基酸脱羧酶，使该种氨基酸脱去羧基生成胺，使培养基呈碱性，此反应需在厌氧、酸性环境中进行，培养基中含有葡萄糖，前期细菌发酵葡萄糖产酸，继续培养时，氨基酸脱羧产胺使培养基变碱，溴甲酚紫为酸碱指示剂，因此溶液呈紫色为阳性反应，黄色为阴性反应。
  注意事项：

  ①由于有些菌分解胨类产碱较快，出现灰紫色或灰白色（如肺炎克雷伯氏菌在鸟氨酸中培养18h时为黄色，24h变为灰白色），判定为阴性；

  ②培养时间不宜超过24h，有些菌分解胨类产碱较多会导致24h后阴性反应变为紫色，形成假阳性，如产气肠杆菌和阴沟肠杆菌等。

  ③观察结果前需注意试验管是否混浊长菌，若未长菌则需重新接种试验，除少数专性需氧菌如铜绿假单胞菌等。 

  5孔为柠檬酸盐利用试验，有些细菌可利用铵盐作为唯一氮源，并同时利用柠檬酸盐作为唯一碳源提供能量进行生长繁殖，分解柠檬酸盐产生碳酸盐和碳酸氢盐，铵盐被分解产生氨，使培养基变碱性，酚红为酸碱指示剂，溶液变红为阳性，未生长颜色不变为阴性；
  注意事项：利用柠檬酸盐阴性菌在此培养基上不生长，有些阳性菌如有些沙门氏菌在此培养基上生长较慢，若观察到培养基浑浊但未变红可继续培养至变红仍可记为阳性。
  6孔为硫化氢试验，有些细菌可分解蛋白胨中的胱氨酸或还原培养基中的硫酸盐产生硫化氢，与硫酸亚铁反应生成黑色的硫化铁，因此培养基变黑为阳性反应，不变黑为阴性反应。
  7孔为脲酶试验，有些细菌可产生尿素酶，分解尿素后产生大量氨，使培养基呈碱性，酚红为酸碱指示剂，因此培养基变红为阳性，变黄或颜色不变为阴性。
  注意事项：由于大量产氨阳性反应为很明显的红色，若24h为阴性，应每天观察结果至7天，7天后不变红为阴性。

  8孔及12-20孔为糖醇类发酵试验，若细菌能发酵利用某种糖或醇，则会产酸使培养基pH下降，溴麝香草酚蓝为酸碱指示剂，因此溶液变黄为阳性，颜色不变或变蓝为阴性；(下图以棉子糖为例）

  注意事项：

  ①有些菌像阪崎肠杆菌、肺炎克雷伯菌等利用糖产酸较快，且继续生长产碱也较快。所以观察结果需较早，从18h开始观察，变黄则记为阳性；最好每隔一段时间观察一次直至48h，期间若变黄则记为阳性。

  ②有些菌发酵糖类为弱阳性可能出现浅绿色、黄绿色等不好判断的结果，可在系统中勾选此项反应。

  ③有些菌为迟缓发酵型，很难在博检条孔中产酸，需根据判定结果调整或补做试验。

  9孔为吲哚试验，有些细菌可分解色氨酸形成吲哚，加入二甲基苯甲醛（靛基质试剂盒）后反应生成玫瑰红色吲哚环，则为阳性反应，加入试剂后若颜色不变，则为阴性反应；

  10孔为V-P试验，有些细菌分解葡萄糖过程中会产生乙酰甲基甲醇，在碱性溶液中乙酰甲基甲醇被氧化后可与胍基反应生成红色化合物，因此加入VP试剂（V-P试剂盒）后变红为阳性反应，颜色不变或棕黄色为阴性反应；

  注意事项：建议培养24-48h，滴加V-P试剂后轻轻混匀，阳性反应可立刻或于数分钟内出现红色，如为阴性，应放在36℃±1 ℃继续培养0.5-4 h 再进行观察。

  11孔为明胶分解试验，明胶溶液在低温下呈固态，某些细菌可将明胶水解为多肽和氨基酸，使明胶失去凝胶性质，因此最终明胶不凝固为阳性，凝固为阴性；（下图所示为明胶阳性与阴性对照）

  注意事项：有些菌水解明胶较慢，所以必要时需延长培养3-7天。

  氧化酶试纸：某些细菌具有氧化酶，可氧化四甲基对苯二胺生成红色的醌类氧化物，因此试纸呈现蓝色至蓝紫色为阳性，颜色不变为阴性。（下图为氧化酶阳性实验结果）

  注意事项：挑取菌落时不能用镍铬丝等金属制品，以防产生假阳性结果。

四、使用方法：

  1、挑取新培养的待检测菌单菌落于9mL生理盐水中制成菌悬液，用酒精棉擦拭打孔器和盖子消毒，将生化鉴定条打孔后，每孔接种100μL菌液，氨基酸需覆盖约300μL无菌石蜡，盖上盖子至于37℃培养18-24h后，观察实验结果。

  2、滴加1-2滴无菌水将氧化酶试纸润湿，使用玻璃棒挑去新鲜菌落涂抹于氧化酶试纸，观察试验结果。

  3、每三孔记为1组，共7组（氧化酶为最后一位），第一孔若阳性记为1，第二孔若阳性记为2，第三孔若阳性记为4，若为阴性则记为0，将每组三孔数值相加，便可得到7个数组成的编码，将此编码输入数据库（如有反应不确定可在前面打对号），读取鉴定结果。

五、实验举例：

  现选取常见17株革兰氏阴性细菌进行试验，试验及鉴定结果如下：

  1、沙门氏菌

  沙门氏菌ATCC14028的试验结果如下图所示：

  系统鉴定结果如下图所示：

  

  2、甲型副伤寒沙门氏菌

  甲型副伤寒沙门氏菌CMCC50093的试验结果如下图所示：

  系统鉴定结果如下图所示：

  3、大肠埃希氏菌

  大肠埃希氏菌ATCC25922的试验结果如下图所示：

  系统鉴定结果如下图所示：

  4、奇异变形杆菌

  奇异变形杆菌CMCC49005的试验结果如下图所示：

  系统鉴定结果如下图所示：

  5、普通变形杆菌

  普通变形杆菌ATCC13315的试验结果如下图所示：

  系统鉴定结果如下图所示：

  6、阴沟肠杆菌

  阴沟肠杆菌ATCC23355的试验结果如下图所示：

  系统鉴定结果如下图所示：

  7、产气肠杆菌

  产气肠杆菌CMCC45103的试验结果如下图所示：

  系统鉴定结果如下图所示：

  8、弗氏柠檬酸杆菌

  弗氏柠檬酸杆菌ATCC43864的试验结果如下图所示：

  系统鉴定结果如下图所示：

  9、产酸克雷伯氏菌

  产酸克雷伯氏菌CICC22913的试验结果如下图所示：

  系统鉴定结果如下图所示：

  10、粘质沙雷氏菌

  粘质沙雷氏菌ATCC13880的试验结果如下图所示：

  系统鉴定结果如下图所示：

  11、福氏志贺氏菌

  福氏志贺氏菌ATCC12022的试验结果如下图所示：

  系统鉴定结果如下图所示：

  12、宋内志贺氏菌

  宋内志贺氏菌ATCC25931的试验结果如下图所示：

  系统鉴定结果如下图所示：

  13、小肠耶尔森氏菌

  小肠结肠炎耶尔森氏菌CMCC52004的试验结果如下图所示：

  系统鉴定结果如下图所示：

  14、副溶血性弧菌

  副溶血性弧菌ATCC17802的试验结果如下图所示：

  系统鉴定结果如下图所示：

  15、霍乱弧菌

  霍乱弧菌非O1的试验结果如下图所示：

  系统鉴定结果如下图所示：   

  16、创伤弧菌

  创伤弧菌ATCC27562的试验结果如下图所示：

  系统鉴定结果如下图所示：

  17、溶藻弧菌

  溶藻弧菌ATCC33787的试验结果如下图所示：

  系统鉴定结果如下图所示：

  综上所述，博检革兰氏阴性细菌鉴定系统适用范围广、准确率高，是革兰氏阴性细菌鉴定的极佳选择。

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