氧化酶试验的操作方法及注意要点

一、试验简介

  氧化酶又名细胞色素氧化酶、细胞色素氧化酶c或呼吸酶。通过氧化酶试验可检测细菌是否能产生该酶，主要用于肠杆菌科细菌与假单胞菌的鉴别，前者为阴性，后者为阳性。奈瑟菌属、莫拉菌属细菌也呈阳性反应。

二、试验原理

  氧化酶为细胞色素呼吸酶系统的终末呼吸酶，氧化酶先使细胞色素c氧化，然后此氧化型细胞色素c再使对苯二胺氧化，生成有颜色的化合物，从而表现为颜色反应。

三、试剂

  1%盐酸四甲基对苯二胺或1%盐酸二甲基对苯二胺。

四、试验方法

  常用方法有以下几种：

  （1）菌落法：直接滴加试剂于被检菌落上。具体操作为，取37℃培养20 h的斜面培养物一支，将2～3滴试剂从斜面上端滴下，并将斜面略加倾斜，使试剂流经斜面上的培养物。如系平板培养物，则可将试剂滴在菌落上。

  （2）滤纸法：取一小块洁净滤纸，沾取少量菌，然后滴加试剂。

  （3）试剂纸片法：将滤纸片浸泡于试剂中制成试剂纸片，刮取菌苔涂于试剂纸上。

  其操作手法如图1所示：

图1  纸片法进行氧化酶试验的操作手法

  （4）拭子法：拭子应浸入试剂中，然后与可疑的分离菌落接触，在10秒钟内注意颜色的变化。

  （5）试管法：取18-24 h的营养肉汤（4.5mL）新鲜细菌培养物。加入试剂（0.2mL），摇动试管，以确保混合物充分混合，观察颜色变化。

五、试验结果

  细菌与试剂接触后，在10秒内呈深紫色，为强阳性；于2min内呈现蓝色者为阳性；阳性培养物大多数于半分钟内出现强阳性反应，2min以后出现微弱或可疑反应均判为阴性结果。

  为保证结果准确性，分别以铜绿假单胞菌和大肠埃希氏菌作阳性和阴性对照。

六、注意事项

  （1）进行测试时，试剂可能会自动氧化，因此使用新鲜试剂至关重要。为保证试剂新鲜，从配制到使用不应超过一周。

  （2）纯化菌时，要选择不含过多糖类的培养基，如营养琼脂和胰蛋白酶大豆琼脂。培养基中高浓度的葡萄糖会导致假阳性结果。

  （3）如果被测微生物在含有染料的培养基上生长，则结果可能会异常。

  （4）在将试剂添加到活性培养物中之前，请先将培养物进行传代培养，因为某些试剂会杀死微生物。

  （5）氧化酶测试有助于鉴定奈瑟菌以及鉴定和区分革兰氏阴性杆菌。为了确定被测生物的革兰氏反应和形态，应使用革兰氏染色进行检查。

  （6）刮取菌苔一定要使用铂金环、一次性塑料接种环或玻璃棒。使用包含铁的环可能会导致假阳性结果。

  （7）如果所用试剂或试剂条的敏感性较低，则可能会导致假阴性结果。

  （8）试纸条上滴加无菌水时，以刚刚浸湿为宜。若加水太多，会影响反应效果，延长反应时间，或无颜色反应，造成假阴性（如图2）。

左：10 uL              右：20 uL

图2  不同用量的无菌水对氧化酶试验结果的影响

  （9）确保用于氧化酶测试的菌落菌龄为18至24小时。较老的菌落，则会导致反应较弱甚至不反应（如图3）。

左：24h菌苔            右：2周菌苔

图3  不同菌龄的菌苔对氧化酶试验结果的影响

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