GB4789.40-2016 克罗诺杆菌属（阪崎肠杆菌）检验方法及结果分析

一、克罗诺杆菌属情况简要介绍

  克罗诺杆菌属（Cronobacter）属于肠杆菌科，革兰氏阴性杆状菌，（0.6～1.0）μm×（1.2～3.0）μm。不形成芽孢，无荚膜，形成周生鞭毛。需氧或兼性厌氧，最适温度为30℃～37℃。37℃培养18h～24h菌落圆形、微凸、光滑湿润、黄色、边缘整齐，直径为2mm～3mm。

  克罗诺杆菌属广泛分布于自然界中，在食品、饮料、加工原料、生产环境等都能分离到该菌。克罗诺杆菌属与散发的或小规模暴发的败血症、脑膜炎、大脑炎、坏死性小肠结肠炎相关。大多数感染被发现于低体重新生儿（如低于2kg）或者早产儿（即妊娠少于37周）。报道死亡率高达50%，但近年来已经降低到20%。克罗诺杆菌的传染源目前还不清楚。但在生产奶粉和其他食品的工厂或家庭中被频繁地检测到。商业生产的未消毒婴儿配方奶粉常被作为该菌暴发时的感染源。虽然婴儿配方奶粉以外的传染源尚未被发现，但是在环境中的传染源可能还是存在的。

二、参考标准

  《GB 4789.40-2016 食品安全国家标准 食品微生物学检验 克罗诺杆菌属（阪崎肠杆菌）检验》点击下载

三、检验方法以及结果分析

  第一法克罗诺杆菌属定性检验

  3.1检验程序

  克罗诺杆菌属检验程序见图1。

图1 克罗诺杆菌属检验程序

  3.2操作步骤

  3.2.1 前增菌和增菌

  取检样100g（mL）置灭菌锥形瓶中，加入900mL已预热至44℃的缓冲蛋白胨水，用手缓缓地摇动至充分溶解，36℃±1℃培养18h±2h。移取1mL转种于10mL mLST-Vm（改良月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤-万古霉素）肉汤，44℃±0.5℃培养24h±2h。

  质控菌株接种到mLST-Vm肉汤中，培养结果如下图所示：

图2 不同细菌在mLST-Vm肉汤上的生长情况

  3.2.2 分离

  轻轻混匀mLST-Vm肉汤培养物，各取增菌培养物1环，分别划线接种于两个阪崎肠杆菌显色培养基平板，显色培养基须符合GB4789.28的要求，36℃±1℃培养24 h±2 h，或按培养基要求条件培养。

  阪崎肠杆菌划线接种到海博阪崎肠杆菌显色培养基平板，培养结果如下图所示：

图3 阪崎肠杆菌在阪崎肠杆菌显色培养基平板上的菌落特征

  挑取至少5个可疑菌落，不足5个时挑取全部可疑菌落，划线接种于TSA平板。25℃±1℃培养48h±4h。

  阪崎肠杆菌接种到TSA平板，有黄色素产生，培养结果如下图所示：

图4 阪崎肠杆菌在TSA平板上的菌落特征

  3.2.3 鉴定

  自TSA平板上直接挑取黄色可疑菌落，进行生化鉴定。可选择生化鉴定试剂盒或全自动微生物生化鉴定系统。

  阪崎肠杆菌氧化酶为阴性，2min内不变色，结果如下图所示：

图4 阪崎肠杆菌氧化酶试验结果

  阪崎肠杆菌接种至HBI阪崎肠杆菌生化鉴定条（GB），结果如下图所示：

图5 阪崎肠杆菌在HBI阪崎肠杆菌生化鉴定条（GB）上的结果

  克罗诺杆菌属的主要生化特征见下表。

表1 克罗诺杆菌属的主要生化特征

  3.3结果与报告

  综合菌落形态和生化特征，报告每100 g（mL）样品中检出或未检出克罗诺杆菌属。

  第二法克罗诺杆菌属的计数

  3.4操作步骤

  3.4.1 样品的稀释

  固体和半固体样品：无菌称取样品100g、10g、1g各三份，分别加入900mL、90mL、9mL已预热至44℃的BPW，轻轻振摇使充分溶解，制成1:10样品匀液，置36℃±1℃培养18h±2h。分别移取1mL转种于10mL mLST-Vm肉汤，44℃±0.5℃培养24h±2h。

  液体样品：以无菌吸管分别取样品100mL、10mL、1mL各三份，分别加入900mL、90mL、9mL已预热至44℃的BPW，轻轻振摇使充分混匀，制成1:10样品匀液，置36℃±1℃培养18h±2h。分别移取1mL转种于10mL mLST-Vm肉汤，44℃±0.5℃培养24h±2h。

  3.4.2 分离、鉴定

  同3.2.2和3.2.3。

  3.5结果与报告

  综合菌落形态、生化特征，根据证实为克罗诺杆菌属的阳性管数，查MPN检索表，报告每100g（mL）样品中克罗诺杆菌属的MPN值（见下表）。

表2 克罗诺杆菌属最可能数（MPN）检索表

相关标准：

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