梅毒螺旋体荧光抗体吸收试验(FTA-ABS)诊断试剂

【原理】

  梅毒感染后，一般经过2~4周的潜伏期在侵入部位出现第1个临床症状-硬下疳，此时体内多已产生可以检出的特异抗体，首先是IgM型，同时伴有IgG型，随着病程的进展，IgG型抗体逐渐升高，至第2期达顶点，以后稍有下降，但一直保持。而且，只要感染过程存在，体内即有 IgM抗体产生，当治疗后感染过程终止，IgM型抗体即消失。因此，检测病人特异IgG型和IgM型抗体，可以确定是否梅毒感染，而在梅毒治疗过程中，IgM型抗体从阳性转为阴性，则是梅毒治愈的标志，但治疗后IgG型抗体可终身保持，并能被FTA-ABS法检出。FTA-ABS试验，是国际上公认的检出梅毒特异抗体的首选方法，其敏感性和特异性均高于其它方法。如对一期梅毒、晚期潜伏和三期复发梅毒的检出敏感性均高于VDRL法。本法以完整的梅毒密螺旋体（Nichols标准毒株）作为抗原，涂于载玻片上，然后加病人血清与之反应，如血清中有特异抗梅毒螺旋体抗体，则必与玻片上的梅毒螺旋体结合，再加上抗人免疫球蛋白荧光抗体，梅毒螺旋体就会被此荧光抗体包被，于荧光显微镜下即可见发特异荧光的形态典型的梅毒螺旋体。

  由于人体内（如口腔、阴道）栖居有其它密螺旋体，它们有时也可引起局部感染，使体内产生相应的抗体，其中部分与梅毒螺旋体有交叉反应。因此，当血清稀释度不高时（如1:5~1:50)，常可使梅毒荧光抗体试验（FTA）出现一定比例的假阳性，而当血清稀释至1:100~1:200时，又可将部分真的梅毒感染漏检。于是，自1969年开始，采用无毒密螺旋体Re-iter株培养液吸收血清中群交叉抗体，使血清在1:5稀释时不会产生交叉反应，从而既提高了方法的特异性，又不降低敏感性。此法即FTA -ABS (Fluorescent Treponemal antibody-absorption)。经过国际上约20年的广泛应用，证明它是血清学方法中一种最成功的方法。仅在美国，每年用此法检验的血清标本数达数千万份之多。根据美国疾病控制中心（CDC）的研究，FTA-ABS的敏感性对一期梅毒为98%，二期为100%，潜伏期为100%，三期（晚期）为96%，对各期的特异性则达98%(95%~99%)。

【成分及制法】

  1.FTA抗原：为从感染梅毒螺旋体标准毒株(Nichols)的家兔睾丸中提取的纯螺旋体，或直接涂于特制载玻片上（此载玻片为10眼、6眼、4眼等型号），经丙酮固定后保存备用；其螺旋体密度为高倍视野20~30条，并衬有羊红血球作背景，或冻于瓶中，低温保存。由使用者自己涂制抗原片方法如下：将干燥抗原加灭菌蒸馏水1ml，振荡至完全溶解，以吸管吸打8~10次，使螺旋体凝团均匀分散，然后涂制抗原基片；用特制或自己用钻石笔刻划的限圈载玻片，每圈涂1白金耳抗原，室温干燥15分钟以上，随即浸入优级丙酮中10分钟以固定螺旋体（每200ml丙酮固定的玻片不应多于50张）；水溶后此抗原应当全部涂制玻片固定后干燥保存于低温下备用（可置于小干燥器中或密封于塑料袋内置冰箱）。

  2.FTA阳性对照血清：为标准化的冻干的已经1:5稀释的梅毒病人FTA- ABS阳性血清，在试剂盒启用初期可与待测的血清同时染色，其螺旋体的荧光亮度应达“++”以上（即螺旋体形态清晰，黄绿色荧光明显）。冻干血清根据瓶签说明稀释。

  3.FTA吸收剂：为特制的用以抑制非特异交叉反应的非致病性密螺旋体培养浸液，以0.2ml加待测热灭活血清0.05ml，成1:5稀释。

  4.羊抗人或兔抗人IgG和／或IgM荧光抗体：为FITC标记的球蛋白，冻干制品0.5ml包装。用时以双蒸水重溶，然后小量（0.2ml）分装冻存备用。抗人IgGFA可用于各期梅毒的检测，指示抗梅毒螺旋体IgG抗体的存在，抗人IgMFA 可用于早期及未治疗的活动性梅毒的检测，抗梅毒螺旋体IgM抗体的存在，表明体内有梅毒螺旋体活动。

荧光抗体水化后，取0.1ml按瓶签指示稀释，对阳性血清染色，用自己的荧光显微镜观察荧光强度，如强度不足，可降低稀释度，如强度很高，则可加大稀释度。用时设FA直接染抗原的阴性对照。

  5.吐温80：用以制备荧光抗体稀释液。将吐温与9.8ml磷酸盐缓冲液分别于水浴加温至56℃，然后吸0.2ml吐温至缓冲液中，充分冲洗吸管，混匀，pH应为7.0~7.2，置冰箱中可长期保存，如pH改变或产生沉淀则弃之。

  6.封片剂：为纯甘油与pH8.6缓冲盐水按9:1混合而成。荧光抗体染色完成后，用毛细管吸取滴加在抗原涂区，量不必过多，以能扩散至盖片全区又不使盖片漂动为宜。此封片剂也可用作镜油。

  7.磷酸盐缓冲液（PBS)：将30g干粉溶于2670ml蒸馏水中，加入1.5ml预热的吐温80用作试验血清的稀释和染色玻片的浸泡。

  8.FTA吸收剂对照：为与梅毒螺旋体有交叉反应的非梅毒病人血清，以PBS1:5稀释，可使螺旋体染成阳性，而用吸收剂稀释，则为阴性，本对照可证明吸收剂的可靠性。

【用途】

  (1)检出各期（从早期到晚期）梅毒病人体液（血、脑脊液等）中的抗梅毒螺旋体的特异IgG和IgM抗体，用以确定梅毒感染诊断和监测疗效。

  (2)供血者检查。

  (3)各种健康査体和婚前检査。

【注意事项】

  1.本试验的标本为病人或被检查者的血清。试验前血清须56℃灭活30分钟，已灭活过的血清也须于试验当天再灭活10分钟。

  2.试验程序：

  (1)抗原片质量检查：利用试剂盒提供的瓶装干燥抗原自已涂制的抗原片，染色前应用暗视野显微术观察一下螺旋体的密度和分布情况，如密度太低或螺旋体成团块者，应重新用吸管或注射器反复抽吸，使螺旋体充分散开，涂制的抗原每高倍视野应不少于10条。

如直接用试剂盒提供的抗原片，则不须检查，可直接进行染色，但从冰冻中取出的抗原片，必须彻底干燥。并缓慢通过酒精灯火焰2次（以不烫手为度）。

  (2)将已灭活的待测血清以吸收剂1:5稀释（0.05ml血清加0.2ml吸收剂），充分混合后于37℃下放置20分钟，使非特异性交叉反应抗体被充分吸收，即取20~30μl加于抗原涂膜上，使涂膜完全覆盖。

阳性和阴性对照血清均分别以PBS和吸收剂同上作1:5稀释处理，然后加于抗原膜上。

荧光抗体对照则于抗原膜上加PBS或吸收剂。

  (3)将以上涂片置于湿盒内，密盖，于35~37℃下孵育30分钟。

  (4)置涂片于玻片架上，以流动PBS冲洗去除已经反应的血清或对照液，然后浸于PBS中5分钟，提拉10次，再换水重复浸洗1次。

  (5)以蒸馏水冲洗5秒钟，吸干。

  (6)以2％吐温缓冲液稀释抗人荧光抗体至工作浓度，每涂膜加10~20μl覆盖。

  (7)重复3、4步骤。

  (8)以封片剂封片，防止压入气泡。

  (9)荧光显微镜检查，宜尽早完成，不能及时镜检的涂片须放置于冰盒内。

  (10)如结果全为阴性，应以暗视野显微术或普通显微术检查一下是否有螺旋体存在。

  3.报告结果：镜检荧光抗体染色的荧光发射强度，是一个相对值，与荧光显微镜的光学系统密切相关，荧光强度的比较，只能在同一装置内进行才有意义，因此，相对荧光强度的判定应以所用荧光显微镜对已知阳性标本的染色情况来加以标化，观察结果一般分3种：

  (1)阳性：螺旋体的荧光强度在1+～4+之间，1+指荧光足以使螺旋形态典型，边界清晰可见。2+以上的荧光强度则有很强的随意性，其差别并无本质上的意义。

  (2)边界：荧光强度＜1+，即弱但肯定。

  (3)阴性：可见背景发红色荧光的血球但见不到螺旋体，或仅有模糊影像。1＋和＜1+的标本宜重试1次（阴性标本不必重试），如重试时为1+或更强，则报告为：“ FTA-ABS阳性”；如不足1＋则报告为：“FTA-ABS阴性”。

  如有必要，强阳性标本可做稀释度测定。荧光抗体可用抗人IgG或抗人IgM，根据诊断要求而定。

（军事医学科学院微生物流行病研究所黄策编 第二军医大学 谢正旸审）

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