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柠檬酸杆菌的检验方法及结果判断

林娇娇
录入时间:2022-10-12 16:45:21 来源:青岛海博生物

一、柠檬酸杆菌简介

  柠檬酸杆菌(Citrobacter),革兰氏阴性兼性厌氧菌。直杆菌、直径约1.0μm,长2.0μm~6.0μm。有呼吸和发酵两种代谢类型。氧化酶阴性,动力试验、ONPG试验阳性,能利用柠檬酸盐,能够液化明胶,DNA酶试验和V-P试验阴性。根据《伯杰氏细菌学分类手册》,柠檬酸杆菌属分为弗氏柠檬酸杆菌(C.freundii)、科氏柠檬酸杆菌(C.diversus)和无丙二酸盐柠檬酸杆菌(C.amalonaticus)三个种。


二、参考标准;

  《SN/T 2552.6-2010 乳与乳制品卫生微生物学检验方法 第6部分:柠檬酸杆菌检验》


三、检测步骤及结果判断

  3.1 增菌

  无菌称取样品100g,10g和1g各三份分别加入2000mL、250mL和100mL样品稀释瓶中,加入9倍预热到45℃的灭菌蒸馏水(1:10稀释),或者将样品直接称量到装有9倍预热到45℃的灭菌蒸馏水的样品稀释瓶中,振摇使样品充分混匀,36℃±1℃培养18h~24h。

  分别移取培养18h~24h的悬液各10mL加入90mL四硫磺酸盐煌绿增菌肉汤(TTB)中,36℃±1℃培养18h~24h。

  四硫磺酸盐煌绿增菌肉汤(TTB)检验原理:

  蛋白胨和牛肉粉提供碳源、氮源和维生素,满足细菌生长的需求;氯化钠可维持均衡的渗透压;碳酸钙能中和细菌产酸及吸收有毒的代谢产物;硫代硫酸钠和四硫磺酸钠结合可抑制肠道共生菌(四硫磺酸钠是在培养基加入碘和碘化钾时形成),而具有四硫磺酸钠还原酶的细菌能在此培养基中繁殖;胆盐和煌绿可抑制大肠群菌和其它革兰氏阳性细菌。

  四硫磺酸盐煌绿增菌肉汤(TTB)用法:

  称取本品93.55g,溶解于1050mL蒸馏水中,加热煮沸,121℃高压灭菌15分钟,临用前加入20%碘液 20mL,0.1% 煌绿10mL,现配现用,不宜久置。培养结果如图1所示:

图1 弗氏柠檬酸杆菌在TTB中的培养结果

  3.2 分离培养

  轻轻混匀增菌液,每份增菌液用接种环接种沙门氏菌志贺氏菌分离琼脂(SS)平板、亚硫酸铋琼脂(BS)平板。采用三区法或四区法划线,以获得单个菌落。将平板倒置于36℃±1℃,SS琼脂平板培养18h~24h,BS琼脂平板培养40h~48h。

  从SS平板和BS平板上分别挑取3个~5个可疑菌落,在营养琼脂斜面上纯化培养。柠檬酸杆菌在SS琼脂平板上的可疑菌落为圆形,粉红色、黑色、无色菌落,或粉红色、黑色中心菌落;在BS琼脂平板上的可疑菌落为棕绿色或棕黑色菌落。

  SS琼脂培养基检验原理:

  䏡胨、牛肉浸粉提供碳源、氮源、维生素和矿物质;乳糖为可发酵的糖类;三号胆盐、枸橼酸钠和煌绿抑制革兰氏阳性菌及大多数的大肠菌群和变形杆菌;硫代硫酸钠和枸橼酸铁用于检测硫化氢的产生,使菌落中心呈黑色;中性红为pH指示剂,发酵糖产酸的菌落呈红色,不发酵糖的菌落为无色;琼脂是培养基的凝固剂。

  SS琼脂培养基用法:

  称取本品63.53g,溶解于1000mL蒸馏水中,加热煮至沸,不必高压蒸汽灭菌,冷至45℃-50℃倒成平板。培养结果如图2所示:

图2 弗氏柠檬酸杆菌ATCC 43864在SS琼脂平板上的培养结果

  亚硫酸铋琼脂(BS)检验原理:

  蛋白胨、牛肉粉在培养基中作为基础营养物质,为细菌生长提供所需的氮源、碳源、维生素及一些矿物质等元素;葡萄糖可作为细菌生长代谢所需的能量物质;磷酸盐对培养环境pH值起到缓冲作用。煌绿和亚硫酸钠能抑制大肠杆菌、变形杆菌和革兰氏阳性菌的生长。伤寒沙门氏菌及其他沙门氏菌能利用葡萄糖,将亚硫酸盐还原成硫化物并与硫酸亚铁反应使得菌落呈黑色,此外还可把铋离子还原成金属铋,使菌落呈现金属光泽,从而使沙门氏菌得到分离。

  亚硫酸铋琼脂(BS)用法:

  称取本品50.3g,加入1000 mL蒸馏水中,加热煮沸至完全溶解,冷至45℃-50℃,摇匀,倾入无菌平皿备用。无需高压灭菌。保存于黑暗处,48小时内使用。培养结果如图3所示:

图3 弗氏柠檬酸杆菌ATCC 43864在BS琼脂平板上的培养结果

  3.3 分离鉴定

  3.3.1 方法选择

  对挑选的菌体进行革兰氏染色,氧化酶试验初步生化鉴定。革兰氏染色阴性,氧化酶试验阴性按3.3.2进行初步生化试验。革兰氏染色结果如图4A,氧化酶试验结果如图4B:

图4 弗氏柠檬酸杆菌ATCC 43864革兰氏染色结果,弗氏柠檬酸杆菌ATCC 43864氧化酶实验结果

  3.3.2 初步生化鉴定

  使用营养琼脂平板或斜面上纯化分离的新鲜培养物(培养时间不超过24h)进行动力试验、ONPG试验、柠檬酸盐试验、DNA酶试验(或明胶液化试验)和V-P试验。动力试验、ONPG试验和柠檬酸盐试验阳性,DNA酶试验(或明胶液化试验)和V-P试验阴性的菌落为柠檬酸杆菌属细菌。再次用营养琼脂纯化培养18h~24h后,进行后续生化试验。初步生化鉴定结果如图5所示:


图5 弗氏柠檬酸杆菌ATCC 43864初步生化鉴定结果

  3.3.3 生化鉴定

  使用营养琼脂上的新鲜培养物(培养时间不超过24 h)按表1各项生化试验进行柠檬酸杆菌各种的鉴定。确证鉴定结果如图6所示:

表1 柠檬酸杆菌属生化鉴定表

确证实验

弗氏柠檬

酸杆菌

(C.freundii)

科氏柠檬

酸杆菌

(C.diversus)

无丙二酸盐

柠檬酸杆菌

(C.amalonaticus)

水杨酸发酵产酸

V(﹣)

V

D-戊糖醇发酵产酸

产硫化氢

V(+)

鸟氨酸脱酸酶

V(﹣)

靛基质

丙二酸盐利用

V(﹣)

注:+:≥90%阳性;(+):75%~89%阳性;d:不同菌株不定;(﹣):75%~89%阴性;﹣:≥90%阴性。


图6 弗氏柠檬酸杆菌确证生化鉴定结果


四、结果判定与结果报告

  4.1 结果判定

  4.1.1 柠檬酸杆菌属

  革兰氏染色阴性,氧化酶实验阴性,生化反应符合3.3.2要求的菌落,判定为柠檬酸杆菌属细菌。

  4.1.2 柠檬酸杆菌

  革兰氏染色阴性,氧化酶实验阴性,生化反应结果与3.3.2和3.3.3中表1的生化反应结果相符,或根据生化鉴定试剂盒、生化鉴定系统鉴定到柠檬酸杆菌属的结果,可判定为特定的柠檬酸杆菌。

  4.2 结果报告

  生化鉴定结果符合柠檬酸杆菌生化特性,按增菌培养的阳性瓶数,应用MPN表,查出每100 g样品中的MPN值。检测结果报告为每100 g样品中柠檬酸杆菌(属或种)的MPN值。

表2 最可能数(MPN)表(95%置信区间)

使用三管法,接种量分别为10.0 g,1.0 g和0.1 g。

阳性管数

MPN

/100g

可信限

阳性管数

MPN

/100g

可信限

10

1

0.1

10

1

0.1

0

0

0

<3.0

-

9.5

2

2

0

21

4.5

42

0

0

1

3.0

0.15

9.6

2

2

1

28

8.7

94

0

1

0

3.0

0.15

11

2

2

2

35

8.7

94

0

1

1

6.1

1.2

18

2

3

0

29

8.7

94

0

2

0

6.2

1.2

18

2

3

1

36

8.7

94

0

3

0

9.4

3.6

38

3

0

0

23

4.6

94

1

0

0

3.6

0.17

18

3

0

1

38

8.7

110

1

0

1

7.2

1.3

18

3

0

2

64

17

180

1

0

2

11

3.6

38

3

1

0

43

9

180

1

1

0

7.4

1.3

20

3

1

1

75

17

200

1

1

1

11

3.6

38

3

1

2

120

37

420

1

2

0

11

3.6

42

3

1

3

160

40

420

1

2

1

15

4.5

42

3

2

0

93

18

420

1

3

0

16

4.5

42

3

2

1

150

37

420

2

0

0

9.2

4.4

38

3

2

2

210

40

430

2

0

1

14

3.6

42

3

2

3

290

90

1000

2

0

2

20

4.5

42

3

3

0

240

42

1000

2

1

0

15

3.7

42

3

3

1

460

90

2000

2

1

1

20

4.5

42

3

3

2

1100

180

4100

2

1

2

27

8.7

91

3

3

3

>1100

420

-

注:如果接种量扩大10倍,分别为100.0g,10.0g和1g时,表中的数字相应缩小10倍。如果接种量缩小10倍,分别为1.0g,0.1g和0.01g时,表中的数字相应扩大10倍,其余类推。


相关标准:

SN/T 2552.6-2010 乳与乳制品卫生微生物学检验方法 第6部分:柠檬酸杆菌检验 点击下载


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注:本文属海博生物原创,未经允许不得转载。

 

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