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耐热大肠菌群检验方法-化妆品安全技术规范(2022年版)



录入时间:2022-11-28 10:21:28 来源:2022年版化妆品安全技术规范

1.范围

  本规范规定了化妆品中耐热大肠菌群的检验方法。

  本规范适用于化妆品中耐热大肠菌群的检验。


2.定义

  2.1 耐热大肠菌群 Thermotolerant coliform bacteria

  系一群需氧及兼性厌氧革兰氏阴性无芽胞杆菌,在44.5℃培养24h~48h能发酵乳糖产酸并产气。

  该菌主要来自人和温血动物粪便,可作为粪便污染指标来评价化妆品的卫生质量,推断化妆品中有否污染肠道致病菌的可能。


3.仪器

  3.1 恒温水浴箱或隔水式恒温箱:44.5℃±0.5℃。

  3.2 温度计。

  3.3 显微镜。

  3.4 载玻片。

  3.5 接种环。

  3.6 电磁炉。

  3.7 三角瓶:250mL。

  3.8 试管: 18 mm×150mm。

  3.9 小倒管。

  3.10 pH计或pH试纸。

  3.11 高压灭菌器。

  3.12 灭菌刻度吸管:10mL、1mL。

  3.13 灭菌平皿:直径90mm。


4.培养基和试剂

  4.1 双倍乳糖胆盐(含中和剂)培养基

  成分:
蛋白胨
40g

猪胆盐
10g

乳糖
10g

0.4%溴甲酚紫水溶液
5mL

卵磷脂
2g

吐温80
14g

蒸馏水
1000mL
  制法:将卵磷脂、吐温80溶解到少量蒸馏水中。将蛋白胨、胆盐及乳糖溶解到其余的蒸馏水中,加到一起混匀,调pH为7.4,加入0.4%溴甲酚紫水溶液,混匀,分装试管,每管10mL(每支试管中加一个小倒管)。115℃高压灭菌20min。

  4.2 伊红美蓝(EMB)琼脂

  成分:
蛋白胨
10g

乳糖
10g

磷酸氢二钾
2g

琼脂
20g

2%伊红水溶液
20mL

0.5%美蓝水溶液
13mL

蒸馏水
1000mL

  制法:先将琼脂加到900mL蒸馏水中,加热溶解,然后加入磷酸氢二钾和蛋白胨,混匀,使之溶解。再以蒸馏水补足至1000mL。调pH值为7.2~7.4,分装于三角瓶内,121℃高压灭菌15min备用。使用前将琼脂融化,于每100mL琼脂中无菌操作加入5mL灭菌的20%乳糖溶液、2mL2%伊红水溶液和1.3mL 0.5%美蓝水溶液,摇匀,冷至45℃~50℃,倾注平皿备用。

  4.3 蛋白胨水(靛基质试验用)

  成分:
蛋白胨(或胰蛋白胨)
20g

氯化钠
5g

蒸馏水
1000mL
  制法:将上述成分加热融化,调pH值为7.0~7.2,分装小试管,121℃高压灭菌15min。

  4.4 靛基质试剂

  柯凡克试剂:将5g对二甲氨基苯甲醛溶解于75mL戊醇中,然后缓慢加入浓盐酸25mL。

  试验方法:接种细菌于蛋白胨水中,于44.5℃土0.5℃培养24h±2h。沿管壁加柯凡克试剂0.3mL~0.5mL,轻摇试管。阳性者于试剂层显深玫瑰红色。

  注:蛋白胨应含有丰富的色氨酸,每批蛋白胨买来后,应先用已知菌种鉴定后方可使用。

  4.5 革兰氏染色液:

  4.5.1 染液制备

  4.5.1.1 结晶紫染色液:

  成分:
结晶紫
1g

95%乙醇
20mL

1%草酸铵水溶液
80mL
  将结晶紫溶于乙醇中,然后与草酸铵溶液混合。

  4.5.1.2 革兰氏碘液:

  成分:

1g

碘化钾
2g

蒸馏水加至
300mL
  将碘与碘化钾先进行混合,加入蒸馏水少许,充分振摇,待完全溶解后,再加蒸馏水至300mL。

  4.5.1.3 脱色液:95%乙醇。

  4.5.1.4 复染液:

  (1)沙黄复染液:

  成分:
沙黄
0.25g

95%乙醇
10mL

蒸馏水
90mL

  将沙黄溶解于乙醇中,然后用蒸馏水稀释。

  (2)稀石碳酸复红液:称取碱性复红10g,研细,加95%乙醇100mL,放置过夜,滤纸过滤。取该液10mL,加5%石碳酸水溶液90mL混合,即为石碳酸复红液。再取此液10mL加水90mL,即为稀石碳酸复红液。

  4.5.2 染色法

  4.5.2.1 将涂片在火焰上固定,滴加结晶紫染色液,染1min,水洗。

  4.5.2.2 滴加革兰氏碘液,作用1min,水洗。

  4.5.2.3 滴加95%乙醇脱色,约30s,或将乙醇滴满整个涂片,立即倾去,再用乙醇滴满整个涂片,脱色10s,水洗。

  4.5.2.4 滴加复染液,复染1min,水洗,待干,镜检。

  4.5.3 染色结果

  革兰氏阳性菌呈紫色,革兰氏阴性菌呈红色。

  注:如用1:10稀释石碳酸复红染色液作复染,复染时间仅需10s。


5.操作步骤

  5.1 取10mL 1:10稀释的检液,加到10mL双倍乳糖胆盐(含中和剂)培养基中,置44.5℃±0.5℃培养箱中培养24h±2h,如既不产酸也不产气,继续培养至48h±2h,如仍既不产酸也不产气,则报告为耐热大肠菌群阴性。

  5.2 如产酸产气,划线接种到伊红美蓝琼脂平板上,置36℃±1℃培养18h~24h。同时取该培养液1~2滴接种到蛋白胨水中,置44.5℃±0.5℃培养24h±2h。

经培养后,在上述平板上观察有无典型菌落生长。耐热大肠菌群在伊红美蓝琼脂培养基上的典型菌落呈深紫黑色,圆形,边缘整齐,表面光滑湿润,常具有金属光泽。也有的呈紫黑色,不带或略带金属光泽;或粉紫色、中心较深的菌落,亦常为耐热大肠菌群,应注意挑选。

  5.3 挑取上述可疑菌落,涂片作革兰氏染色镜检。

  5.4 在蛋白胨水培养液中,加入靛基质试剂约0.5mL,观察靛基质反应。阳性反应液面呈玫瑰红色;阴性反应液面呈试剂本色。


6.检验结果报告

  经上述检验步骤,若发酵乳糖产酸产气,平板上有典型菌落,并经证实为革兰氏阴性无芽胞短杆菌,靛基质试验阳性,则可报告被检样品中检出耐热大肠菌群。

 

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