微生物的生长测定方法

  描述不同种类、不同生长状态微生物的生长情况，需要选用不同的测定指标。由于考察的角度、测定的条件和要求不同，形成了许多微生物生长测定的方法。具体如下：

一、直接法

  （1）显微计数法

  ① 血球计数板法，将一定稀释度的细胞悬液加到固定体积的计数器小室内，在显微镜下观测小室内细胞的个数，计算出样品中细胞的浓度。适用于单细胞微生物的测定，不适于多细胞微生物。一般不能鉴别菌体死活。

  ② 染色计数法，预先在细胞悬液中加入染料，可分辨出死菌和活菌。

  （2）比色法或比浊法

  快速、简单测定悬液中细胞数量。因菌体不透光，所以在一定浓度范围内，悬液中单细胞的数量与光密度成正比。不适用多细胞生物的生长测定。

  （3）干重测定法

  将细胞培养液离心或过滤后，洗涤除去培养基的成分后转移到适当的容器中，置100-105℃干燥箱烘干或低温低压干燥（60-80℃）至恒重后，称重。为避免误差，培养液中除细胞以外不能有固体颗粒。

  （4）菌丝长度测定法

  ① 固体培养基培养法，将真菌接种在平血的中央，定时测定菌落的直径或面积。该法不能反映菌丝的纵向生长。接种量也会影响测定结果。

  ② U形管培养法，U型管底部铺设一层培养基，将真菌接种在U形管的一端，定时测定菌丝的长度。

  （5）细胞堆积体积测定法

  将细胞悬液装入毛细沉淀管内，在一定条件下离心，根据堆积体积计算含菌量。或将发酵液直接装入常用的刻度离心管内，经过一定转速和时间的离心，从得到沉淀的体积推测出细胞的质量。

  （6）平皿菌落计数法

  将发酵液稀释后涂布在固体培养基表面，或将经过灭菌后冷却至45~50℃的固体培养基与一定稀释度和体积的菌悬液混合，凝固后培养适当时间，测定菌落形成单位的数目。较适合于细菌和酵母菌等单细胞微生物计数，不适于霉菌等多细胞微生物。可反映样品中活菌的数量。

  （7）液体稀释法

  对未知菌样做连续的10倍系列稀释。根据估计数，从最适宜的3个连续的10倍稀释液中各取5ml试样，分别接种3组共15支装有培养液的试管中（每管接入1ml）。经培养后，记录每个稀释度出现生长的试管数，然后查最大可能数

  （8）粒子计数器法（电阻法）

  将一电极放入一带微孔的小管内，从小管上端抽真空，将会造成含有细胞电解液从微孔吸入管内。由于电极间有电压，当细胞通过微孔时，电阻增大，电阻会引起电流脉冲，脉冲数目反映了通过的粒子数。计数器吸入样品的体积已知，可计算出细胞粒子的浓度。另外，电阻的大小与细胞大小成正比，所以脉冲强度也反映了细胞粒子的大小。

二、间接法

  （1）根据细胞组分含量进行估算

  每种细胞中核酸和蛋白质等组分的含量占有一定的比例，根据各组分的含量可间接估算出细胞含量。但在微生物细胞分批培养的不同生长阶段，细胞组成所占的比例可能有变化。

  （2）从培养基成份的消耗量来估算

  选择一种不用于合成代谢产物的培养基成份为检测对象，如磷酸盐、硫酸盐和镁离子。从这些成分的消耗量可间接的估算出菌体的生长速度。若发酵的主要产品是菌体本身，也可从碳源或氧的消耗来估算。

  （3）从细胞代谢产物来计算

  在有氧发酵中，CO₂是细胞代谢的产物，它与微生物生长密切有关。在全自动发酵罐中大多采用红外线气体分析仪来测定发酵产生的CO₂，进而估算出微生物的生长量。

  （4）从发酵液的黏度来估量

  随着菌体量的增加以及黏性的发酵产物的形成，发酵液的黏度会显著地增大。发酵菌体裂解或染菌等不正常情况也会造成发酵液黏度的增大或降低，从而增加估算的误差。

  （5）从发酵的放热量来估算

  产热是微生物生长中的普遍现象。

  （6)以发酵液的酸碱度来估量

  在某些特定情况下，培养基pH值的变化能较好地反映底物的消耗和微生物的生长。如氨的利用结果是释放出H⁺，导致pH值下降；硝酸盐作为氮源，氢离子被从培养基中移去，导致pH值上升。

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