去除细胞壁是制备原生质体的关键。一般都采用酶解法去壁。根据微生物细胞整组成和结构的不同，需分别采用不同的酶，如溶菌酶，纤维素酶，蜗牛酶等。有时需结合其他一些措施，如在生长培养基中添加甘氨酸、蔗糖或抗生素等，以提高细胞壁对酶解的敏感性。部分微生物的去壁方法如下：
1、革兰阳性菌
革兰阳性菌的细胞壁主要由肽聚糖组成。溶菌酶是一种内N-乙酰胞壁酰胺酶，能切开肽聚糖中N-乙酰氨基葡萄糖胺和N-乙酰胞壁酸之间的β-1，4-糖苷键。溶菌能溶解微球菌、枯草杆菌、巨大芽孢杆菌、黄色八叠球菌等革兰阳性菌的细胞壁。
2、革兰阴性菌
革兰阴性菌的细胞壁主要由肽聚糖和脂多糖组成。溶菌酶对革兰阴菌不能直接溶壁，只有当乙二胺四乙酸 （EDTA）存在时，某些革兰阴性菌的细胞壁才能够被溶菌酶溶解。溶菌酶不能溶解金黄色葡萄球菌的细胞壁，而表皮葡萄球菌能产生一种内肽酶——葡萄球菌素可以切开肽聚糖中肽的连键，可以用于溶解葡萄球菌的细胞壁。
3、放线菌
放线菌的细胞壁结构类似于革兰阳性菌也可采用溶菌酶。
4、真菌
真菌细胞壁主要由纤维素、几丁质和葡聚糖等组成。青霉菌多用纤维素酶和α-1，3-糖苷酶等溶壁；曲霉用β-1,3-糖苷酶和β-1,4-糖苷酶等。不同菌种往往需要不同的酶或多种酶混合使用才能达到较好的溶壁效果。蜗牛酶能较好地溶解酵母菌细胞壁中的葡聚糖和几丁质等成分。
在菌体生长的培养基中添加甘氨酸，可以使菌体较容易被酶解。甘氨酸的作用机理并不十分清楚，有人认为甘氨酸渗入细胞壁肽聚糖中代替D-丙氨酸的位置，影响细胞壁中各组分间的交联度。不同菌种对甘氨酸的最适需求量各不相同。在菌体生长阶段添加蔗糖也能提高细胞壁对溶菌酶的敏感性。蔗糖的作用可能是扰乱了菌体的代谢，最适的蔗糖添加浓度随不同菌种而变化。因为青霉素能干扰肽聚糖合成中的转肽作用，使多糖部分不能交联，从而影响肽聚糖的网状结构的形成，所以，在菌体生长对数期加人适量青霉素，就能使细胞对溶菌酶更敏感。
菌龄也是影响溶壁的因素之一。一般处于对数生长中期细胞的细胞壁中肽聚糖含量很低，对溶菌酶敏感。
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