新的微生物菌种需要从自然生态环境中混杂的微生物群中挑选出来，因此必须要有快速而准确的新种分离和筛选方法。分离微生物新种的具体过程大体可分为采样、增殖、纯化和性能测定等步骤。
1、采样
根据筛选的目的、微生物分布情况、菌种的主要特征及其生态关系等因素，确定具体的时间、环境和目标物进行采样。
土壤是微生物的大本营，菜园和耕作层土壤是有机质较多的土层，常以细菌和放线菌为主；果园树根土层中，酵母菌含量较高；动植物残体及霉腐土层中，分布着较多的霉菌。此外，豆科植物根系土中，往往存在根瘤菌；河流湖泊的淤泥中能分离到产甲烷菌；油田和炼油厂周围土层中常见分解石油的微生物等。季节、表面的植被、温湿、通风情况、养分、水分、酸碱度和光照等都会影响土壤中的微生物分布，故在采土样时应予以重视。采土样地点选好后，用小铲子去除表土，取离地面5~15cm处的土样几克，盛于预先灭菌的牛皮纸袋中扎紧，并标明时间、地点和环境等情况，以备查考。
各种水体也是工业微生物菌种的重要来源，许多具有光合作用能力的微生物及兼性或专性厌氧微生物都能从各种水体中筛选得到。
2、增殖
一般采用增殖培养（又称富集培养）的方法，以投其所好和取其所抗的原则在培养基中添加特殊的养分或抗菌物质，使所需菌种的数量相对增加。其实质是使天然样品中的劣势菌转变为人工环境中的优势菌，便于将它们从样品中分离。
3、纯化
增殖培养得到的微生物培养物仍是一个各类微生物的混合体。为了获得某一特定的微生物菌种，必须进行微生物的纯化即纯培养。
常用的菌种纯化方法很多，大体可分为两个层次，一个层次较粗放，一般只能达到“菌落纯”的水平，从“种”的水平来说是纯的，其方法有划线分离法，涂布分离法和稀释分离法。
① 划线分离法，简便而快速，即用接种针挑取微生物样品在固体培养基表面划线，适当条件下培养后，获得单菌落。
② 涂布分离法，与划线法类似，用涂布棒蘸取培养液，或先将少量培养液滴在固体培养基表面，再用涂布棒在固体培养基表面均匀涂布。
③ 稀释分离法所获得的单菌落更加分散均匀，获得纯种的概率较大。该法是将降至60℃左右的固体培养基与少量培养液(事先在培养液中加入无菌的玻璃珠搅拌打散细胞团，再经过滤处理，效果更佳。混匀后，再浇注成平板以获取单菌落。
另一层次是较为精细的单细胞或单孢子分离法，它可达到细胞纯即“菌株纯”的水平。这种方法的具体操作的方法很多，最简便的方法是利用培养皿或凹玻片等分离小室进行细胞分离。也可以利用复杂的显微操作装置进行单细胞挑取。如果遇到不长孢子的丝状菌，则可用无菌小刀切取菌落边缘稀疏的菌丝尖端进行分离移植，也可用无菌毛细管插入菌丝尖端，以获取单细胞。在具体的工作中，具体方法，应视微生物的实际情况和实验条件而定。
为了提高分离筛选工作的效率，除增殖培养时，应控制增殖条件外，在纯种分离时，也应控制适宜的培养条件，并选用特异的检出方法和筛选方案。
4、性能鉴定
菌种性能测定包括菌株的毒性试验和生产性能测定。若毒性大而且无法排除者应予以淘汰。尽管在菌种纯化中能获得大量的目标菌株，它们都具备一些共性，但只有经过进一步生产性能测定，才能确定哪些菌株更符合生产要求。
直接从自然界分离得到的菌株为野生型菌株。事实上，从自然界直接获得的野生型菌种往往低产甚至不产所需的产物，只有经过进一步的人工改造才能真正用于工业发酵生产。所以，我们常将这些自然界中直接获得的新菌株称为进一步育种工作的原始菌株或出发菌株
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