湿热法就是利用水蒸气的热量将物品灭菌。湿热灭菌时，微生物死亡与细胞蛋白质等大分子变性有关，其 Q10值比干热灭菌的高，对芽抱 (在100~135℃)约为8~10，对营养细胞则更高，因此，湿热灭菌比干热灭菌更有效。湿热灭菌具有经济和快速等特点，广泛用于培养基和发酵设备等的灭菌。常用湿热法有以下几种：
（1）巴斯德消毒法
19世纪60年代，由巴斯德发展起来的。将待消毒的液体食品置于60~85℃下处理15s~30min，然后迅速冷却。该法主要针对牛奶、啤酒、果酒和酱油等不易长时间高温灭菌的液体食品。其目的是杀死无芽抱的病原菌(如牛奶中的结核杆菌和沙门杆菌)，但又能保持食品的风味，而且处理后的牛奶等饮料可存放长达 6个月。
（2）煮沸消毒法
将饮用水加热至100℃，煮沸数分钟，以达到消毒的目的。在条件有限的情况下，可采用该法消毒物品。
（3）间歇灭菌法，或称丁达尔灭菌法
在 80~100℃蒸煮15~60min，再搁置室温(28~37℃)下过夜，并重复以上过程三遍以上。其中蒸煮过程可以杀死微生物的营养体，但不能杀死芽抱，室温过夜促使芽抱萌发形成营养体，再经蒸煮过程可杀死新的营养体，循环三次以上可以保证彻底杀死包括芽抱在内的微生物。这种方法可以在较低的温度下，达到彻底灭菌的目的，对设备的要求较低，适用于不耐高温的物品灭菌，但其缺点是费时。
（4）常规加压灭菌法
蒸汽加压灭菌是目前应用最广、最有效的灭菌手段。实验室常用高压蒸汽锅灭菌，该法适用于一切微生物实验室、医疗保健单位和工厂菌种室的培养基、器材和其他物料的灭菌。
（5）连续灭菌法
将培养基在发酵罐外按需要连续不断地加热、保温和冷却，然后送入发酵罐内。一般采用 135~140℃、5~15s短暂的加热过程，然后需要在维持罐内继续保温5~8min，以达到彻底灭菌的目的。
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