支原体肉汤培养基的原理和使用方法

一、支原体简介

  支原体结构简单，缺乏细胞壁，仅有质膜，胞体内有核蛋白体以及一个由环形双链DNA分子组成的原核。大小仅有0.1~0.3μm，最小直径约为100毫微米，可通过滤菌器，会干扰细胞培养等工作的进行。由于能形成丝状与分枝形状，故称为支原体。

  不同支原体利用的能源物质不同，如发酵葡萄糖的肺炎支原体、人型支原体等，水解精氨酸的口腔支原体等，还有利用尿素作为能源的解脲支原体。可利用发酵葡萄糖、水解精氨酸、水解尿素等生化反应鉴别支原体。

  支原体营养要求一般比细菌高，除必须的基础营养物质外，还需添加10%~20%的动物血清以提供支原体所需的胆固醇。由于大多数的支原体兼性厌氧，有些菌株在活化分离时保持5%~10%二氧化碳环境生长状态更好。解脲支原体在厌氧条件下生长更好。

  支原体无细胞壁，对渗透压敏感，对抑制细胞壁合成的抗生素不敏感，因此可添加青霉素抑制细菌的生长。由于渗透压突变会导致支原体破裂死亡，因此培养支原体时，维持适宜的渗透压显得格外重要。此外，在支原体培养中，pH也是重要因素。

二、肺炎支原体检验依据及培养基原理

  支原体检查法在2020年版《中华人民共和国药典》中体现，要求使用支原体肉汤培养基培养监测肺炎支原体。具体操作要求为：将肺炎支原体稀释至10^-7~10^-9，接种在支原体肉汤培养基中，每个稀释度接种3支试管，置于36℃培养7-14天，观察培养基变色结果。肺炎支原体可以发酵培养基中的葡萄糖，使培养基的pH值降低，遇指示剂酚红使培养基变黄。

  猪胃消化粉、牛肉浸粉、酵母浸粉提供碳氮源、维生素和生长因子；葡萄糖为可发酵的糖类；氯化钠维持渗透压；酚红为指示剂。

三、培养基配方（g/L）

四、试验方法

  1、称取本品27.52g，加热溶解于800mL蒸馏水中，121℃高压灭菌15分钟，冷至室温，无菌操作加入灭活小牛血清或马血清200mL和青霉素80万单位，混匀，分装无菌试管，备用。

  2、制备质控菌株，接种到培养基中，并梯度稀释至-9，并做空白对照。

  3、放置于36℃±1℃恒温培养箱中，需氧培养7-14天。

五、试验注意事项

  1、若使用非一次性试管等容器进行试验，容器使用前应使用蒸馏水冲洗干净，确保无洗涤液等残留物，以免增加试验的不确定性或污染。

  2、灭菌结束后，试管口会有水珠，在进行梯度稀释时，水珠很容易与空气中的细菌接触以致污染，因此，试管口应灼烧至干燥，胶塞也需过火，振荡操作后，若培养基接触到胶塞，还需再次进行灼烧管口。

  3、调节pH时，使用的酸碱试剂均应是灭菌后的。

  4、支原体培养前应使用封口膜封口，可提供微需氧环境以及降低污染的风险。

六、质控结果

  接种以下质控菌株，放置于36℃±1℃恒温培养箱中，需氧培养7~14天。培养至12天的试验结果如图1所示。

图1 支原体肉汤培养肺炎支原体12天的灵敏度

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