探讨药品微生物限度检查中的误差影响因素及改进措施

  药品微生物限度检查(以下简称微限)的目的是确定药品(含原料及辅料)是否污染微生物或其污染微生物的程度，将微生物的种类和数量限制在一定的范围之内或者不得检出，是保证用药的有效性、保障药品安全性的重要措施。也是衡量药品生产，流通以及使用全过程微生物控制水平的主要依据之一。科学技术的进步，药品生产工艺的提高以及人民对药品安全理念的不断提升，促使药品检验标准不断提高，微生物限度检查作为药品质量的安全性评价指标也不例外。我国的首版药典于1953年出版，但开展药品微生物污染检查工作始于1972年，《中国药典》(1995年版)初次收载了微生物限度检查法，2000年版首次收载了微生物限度标准，2015年版形成了较为完善的药品微生物控制标准体系，并解决了基本与美国药典等国际人用药品注册技术要求国际协调会(ICH)方案接轨。《中国药典》(2020年版)进一步促进了药品微生物实验室的管理与国际接轨，实现了微限检查由最终产品检验向过程控制的改变。为了提升药品微生物实验室的检验能力，选取了2019年1月至2020年12月期间实验室微限检查结果作为样本，对微限检查误差来源进行回顾性梳理，以期减少或避免误差出现的概率，保证微限检查结果的准确性。

1 资料与方法

  1.1 资料

  选取2019年1月-2020年12月，本实验室承担的药品微限检查共870批，其中片剂372批、丸剂187批、颗粒剂227批、口服液84批。对研究药品微限检查误差的相关文献进行检索，并分类整理。

  1.2 方法 

  按照标准对870批药品进行微限检查，记录发生误差的情况，分析误差产生的来源并对检验中出现的误差进行统计，采用Microsoft Office Excel 2007进行整理分析，以回顾性分析的方法探究出现误差的影响因素，了解其分布情况。同时对比文献研究数据，观察本实验室与其他地市级药品检验机构的差异，以期在未来的工作中减少误差发生率。

2 结果

  对上述870批药品微限检查的统计结果显示，有42批次(4.8%)因受到操作环境、供试液制备等因素影响导致检验结果出现偏差。影响因素、误差例数及占比情况见表1。

  通过中国知网数据库查阅文献资料，选取部分高同质性的药品检验机构微生物实验室的文献资料，研究统计并进行综合分析，共1180例误差数据，详见表2。

  表1和表2对比情况见图1。可以看出，药品微限检查误差中，影响因素主要来自六个方面，其中供试液制备时出现误差比例最高，其次是培养基，另外依次是检验设备及用具、操作环境、菌落计数和药品自身性质。本实验室和其他地市实验室统计结果基本一致。

图1本实验室与其他地市药检机构误差影响因素所占比例对比图

3 误差影响因素的分析及探讨

  药品微限检查目前最常用的方法是生物学检验技术，该技术操作程序较为繁琐、检验流程要求紧密严格，检验周期较长，导致出现干扰因素的环节较多，容易导致检验结果出现误差。因此，总结分析误差影响因素，在今后的检验工作中给予充分关注，可以减少误差出现的概率，保证检验结果的准确性与可靠性。

  3.1 供试液制备

  供试液制备是误差发生的主要因素，该工作目前主要由检验人员完成，没有自动化仪器设备可以替代。因此，检验人员的专业素养、理论知识、操作技能和工作经验是严格规范操作、保证结果准确性的基础。

  供试液制备时应保证样品的真实污染状态，既不能杀死样品本身污染的微生物，也不能污染样品，还要避免操作不当导致样品污染实验环境。要通过方法适用性检查，保证供试液不具有或者消除其杀菌及抑菌活性。在注皿之前，应保证样品分散均匀，避免吸取供试液的沉淀物或上清液造成结果偏离。为防止细菌增殖，制备过程要稳、准、快，从供试液制备到倾注培养基整个操作过程应严格控制在1小时内，避免时间过长对检验结果造成影响。

  鉴于药检机构成立时间早，人员更新慢，专业结构不合理，人员老化较为严重，现有工作人员大部分经历了多版药典的实施。有些人员学习能力较差，学习意识淡泊，不能及时跟进检验标准的变化，不能有效理解新版药典微限检查的操作要求，容易在操作中出现失误，最终导致出现错误的结果。主要表现在以下几个方面：一是有些药检机构认为微限检查不使用大型精密仪器，检验方法较为单一，对人员和技术要求不高。在人员配置时将非微生物学专业毕业的人员、无相关微限检查工作经历的人员安排到微限检查岗位； 二是药检机构中相比较于理化检验人员，微限检查人员较少，考虑到培训成本，“请进来”的培训几乎没有。除了技术骨干极少的外出培训机会，大多靠检验人员自学，学习的自觉性、学习的效果均难以追踪考核； 三是上岗考核流于形式。对于新进人员或者转岗人员，上岗考试基本以笔试为主，形式大于内容，对操作技能重视不够。

  3.2 培养基

  培养基是微生物检验的基础，直接影响微生物检验结果。目前，大部分实验室使用商品化培养基，收到培养基后应对品名、批号、生产厂家及有效期等进行初步验收，使用前应进行适用性检查，适用性检查符合要求方可使用。开瓶时应注明开瓶日期和经验证的有效期，一旦发现受潮结块等现象，应立即停止使用。使用时应按标签标识的说明进行配制，配制时应充分溶解，一般采用湿热灭菌法。为保证灭菌时既不破坏有效成分，又要保证灭菌彻底，需按照经验证的灭菌条件操作。应确定每批培养基灭菌后的pH值的范围(冷却至25℃左右测定)，温度过高测定pH值时颜色反应可能有误差。灭菌后的培养基pH值如果测定时超出范围，不便调整。因此，建议实验室在灭菌前测定培养基pH值，一旦超出范围，应缓慢滴加适宜的碱液或者酸液进行调整，添加过量导致再矫正时，培养基的灵敏性可能降低，影响菌落生长。

  陈晓燕指出灭菌后的培养基可以在2～8℃放置60天，但因为各实验室温度、相对湿度、冰箱性能等控制条件有差异，如要延长保存时间，需要在本实验室开展验证。因此，建议临用新制，避免培养基保存期间导致的促生长能力、抑制能力及指示特性下降。

  3.3 检验设备及用具 

  仪器设备应定期进行检定/校准，不得使用超过检定/校准周期的仪器设备。仪器设备运行期间，应严格按照维护计划执行，以保持良好的工作状态。影响实验结果准确性的关键设备有高压灭菌器、冰箱以及培养箱，在运行过程中对温度、压力等关键参数要连续观测，并做好记录，尤其是高压锅，遇到仪器出现故障时要及时发现并处置，避免出现意外伤害事故。本实验室曾有一台高压灭菌器在达到灭菌条件和灭菌时间后，仍然保持高温高压，为防止意外，只能强制断电中止设备运行，本次灭菌的培养基作废弃物处理。

  检验中用到的玻璃仪器等用具均需进行灭菌，目前大部分实验室改用一次性无菌培养皿，省去了培养皿清洁和灭菌的繁琐。但使用一次性无菌培养皿前，尤其在更换生产厂家后，应注意验收，可选用少量与库存培养皿进行对比试验。本实验室曾在某次实验时出现多批不同品种样品菌落数超标，同时阴性对照有菌落生长，当次实验结果全部作废。启动偏差调查，经回顾性分析和反复讨论，考虑是新到货培养皿的问题。使用原库存的培养皿进行对比验证后，确认是培养皿不合格，随即联系供应部门对该批次培养皿进行了退换，同时建议供应部门加强对供应商的评估。

  3.4 操作环境

  为降低或避免交叉污染，微限检查应在不低于D级背景下的生物安全柜或B级洁净区域内进行，且操作区域内应为单向流空气。为保持环境的适宜性和有效性，年初应制定环境监测计划，定期监测浮游菌、沉降菌、压差等重要参数。空调洁净系统长时间运行后，初效、高效过滤网更换不及时，会有洁净度不符合要求的风险。检验人员应具有无菌意识，将无菌观念铭记在心，落实在细节处。

  检验前要做好充分的准备工作，将所需物品全部放进无菌室，检验过程中严禁进出实验室取用实验用品。在无菌室内检验用具要保存在固定位置，杜绝随意移动，无关物品禁止入内。生物安全柜应保持台面清洁，使用前按规定进行消毒，还要定期委托有资质的第三方实验室进行校准，对滤网等关键配件要定期清理或更换。实验中人员是洁净室内主要的发尘源，单位面积内人员越多，对实验环境影响越大，实验结果的可信度越差。因此，实验时无关人员禁止入内，同时检验操作应平稳有序，严禁人员频繁走动、接打电话，以避免搅动空气中的尘埃粒子，影响检验结果。

  3.5 菌落计数 

  菌落计数方法首先要考虑方法的选择及确认。一般首选操作过程简单的方法，常用的是低稀释级(1∶10稀释液)平皿倾注法，从而减少操作繁杂带来误差或者损伤微生物。其次选用增加稀释倍数或培养基体积、添加中和剂或灭活剂等去除或灭活供试液的抗菌活性，再次选择薄膜过滤法，或者上述几种方法联用。最可能数法因为精密度及准确度较差一般不选用。无论采取哪种方法，均要考虑所添加的表面活性剂、中和剂、灭活剂等试剂对微生物无毒性，同时确认所用试剂的相容性，避免发生反应影响检验结果。实验中一定要进行阴性对照试验，在出现菌落生长时，便于区分药品自身情况还是操作环境等其他因素影响。

菌落计数时一般通过直接观察，在平皿的背面进行菌落计数，计数时应注意平皿边缘生长的菌落，同时注意区分菌落和颗粒物、胶囊壳碎片等，可借助放大镜、低倍显微镜观察，必要时挑取可疑物进行涂片镜检。

药典中规定的有需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数、控制菌检查。微生物广泛存在于自然界中，药品中污染微生物的种类有可能不在其规定范围内。出现不明菌落时，应进行鉴定，确定污染的原因并及时采取预防措施。一旦确定是样品自身原因，应立即上报监管部门，避免发生药害事件。

  3.6 药品自身性质

  合格的药品是生产出来的，不是检验出来的。在药物生产、运输、存储过程中，都有可能会污染微生物。药品的生产环境、工艺、设备、原料及辅料、质量控制方法及水平和生产人员等均有可能带来药品微生物的污染。

  实验室收到样品后，首先应做好唯一性标识，避免样品混淆，尤其针对三同样品(同品种同厂家同批号)。应严格按照说明书上记载的贮藏方式保存样品，最大限度保持样品原始状态，避免样品贮藏条件比如相对湿度过高、温度过高等不符合要求导致的微生物污染。

  药品中可能含有防腐剂，如果防腐剂未被中和或灭活，平板计数结果往往会受到影响，如低稀释级菌落生长数量较少，而高稀释级菌落生长数量反而增大，遇此情况应重复试验，确定是药品自身性质影响还是操作技术造成的误差。样品的给药途径、抑菌程度等因素会影响检验方法的选择，不同的检验方法又可能带来不同的误差来源。

4 讨论及改进措施

  针对误差因素的分析，有条件的实验室应配备微生物及相关专业毕业、有较高专业知识水平的人员。检验人员上岗前，必须进行严格的岗前培训，要熟练操作仪器设备，明确无菌操作要求，按规定制备培养基、洁净室的消毒、培养基及废弃物的灭菌、平板制作、菌落的计数方法、菌落的鉴定、菌种的保藏及传代、洁净室的微生物监测等。要对检验人员加强生物安全培训，熟悉安全操作规范和灭菌消毒知识，保证自身安全的同时，也能有效防止实验室被微生物污染。

  出现不合格结果时，应及时启动偏差调查，评估是样品的原因还是实验室误差。积极参加外部组织的能力验证等方式外，可在实验室内部开展盲样检测等活动来考察检验技能和水平。当开展新项目、使用新方法或新技术时，检测开始前对其操作技能要进行专项评估确认。

  药典中的微限检查对象是活的微生物，而药品中污染的微生物具有分布不均匀性。同一批次药品可能部分被污染;被污染的药品中，污染微生物的数量可能也不一致;被污染药品微生物种类可能比较复杂，也可能比较单一。微生物具有族团性，其大小及紧密程度具有遗传性，族团的分化性差异极大，进一步强化分布不均匀性。针对上述特点，抽样时应严格遵守抽样指导原则，保证样品具有代表性。

  要强化检验人员对微限检查全过程的质量控制意识，做到以药典指导原则为纲，落到细处，落到实处。建立本实验室微限检查的标准操作规程，使微限检查逐步趋向规范化，标准化，既要防止假阳性结果，更要避免假阴性结果，应客观反映出药品中微生物污染程度，确保检验结果的准确性，为药品安全有效提供技术支撑。

来源：菏泽市食品药品检验检测研究院 曹鲁娜 毕言锋 任仲丽 毕天琛 李怀伟 

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