PPLO肉汤培养基的原理和使用方法

一、用途及试验原理

  用于支原体分离和培养的基础培养基。

  䏡胨、蛋白胨、牛肉浸粉、牛心浸粉提供氮源、维生素、氨基酸和生长因子；氯化钠可维持均衡的渗透压。

二、培养基配方（g/L）

三、试验方法

  1、称取本品21 g，加热溶解于700 mL蒸馏水中，121℃高压灭菌15分钟，冷至50℃-60℃时加入300 mL添加剂（包括200 mL马血清和100 mL除菌的新鲜酵母浸液），混匀，备用。

  新鲜酵母浸出液制备方法：取500 g鲜酵母或250 g酵母干粉，加入至1.5 L双蒸水中，搅拌均匀，充分溶解后煮沸15 min，快速冷却，4000 r/min离心15 min，取上清液，再煮沸15 min，冷却后用0.22 μm微孔滤膜过滤除菌或116℃高压灭菌20 min。

  为简化操作，可使用酵母浸粉配制的溶液替代新鲜酵母浸液，酵母浸粉溶液的配制方法为，将5 g酵母浸粉添加至100 mL蒸馏水中混匀，可替代100 mL新鲜酵母浸出液。

  2、制备质控菌株，接种至培养基中，做10倍系列稀释，稀释至10-9，并做空白对照。

  3、放置于36℃±1℃恒温培养箱中，微需氧培养7-14天。

四、试验注意事项

  1、培养肺炎支原体时，培养基需额外添加葡萄糖（为可发酵的糖）；培养口腔支原体时，培养基需额外添加精氨酸（为可水解的氨基酸）；进行灵敏度试验时需额外添加酚红（指示剂）。

  2、由于马血清为深黄色，培养基添加马血清后，会干扰结果判定，为解决这一问题，可将培养基的pH调至偏上限，如pH值为7.9。

  3、若使用非一次性试管等容器进行试验，容器使用前应使用蒸馏水冲洗干净，确保无洗涤液等残留物，以免增加试验的不确定性或污染。

  4、灭菌结束后，试管口会有水珠，在进行梯度稀释时，水珠很容易与空气中的细菌接触以致污染，因此，试管口应灼烧至干燥，胶塞也需过火，振荡操作后，若培养基接触到胶塞，还需再次进行灼烧操作。

  5、调节pH时，使用的酸碱试剂均应是灭菌后的。

  6、支原体培养前应使用封口膜封口，可提供微需氧环境以及降低污染的风险。

五、质控结果

  接种以下质控菌株，放置于36℃±1℃恒温培养箱中，需氧培养7~14天。肺炎支原体、口腔支原体分别培养至11、5天的试验结果分别如图1、2所示。

图1 PPLO肉汤培养基培养肺炎支原体11天的灵敏度

图2 PPLO肉汤培养基培养口腔支原体5天的灵敏度

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