空肠弯曲菌检验

   
   1　主题内容与适用范围
　　本标准规定了空肠弯曲菌的检验方法。
　　本标准适用于食品和食物中毒样品中空肠弯曲菌的检验。
　　2　引用标准
　　GB 4789.28　食品卫生微生物学检验染色法、培养基和试剂
　　3　设备和材料
　　3.1　温箱：42±1C。
　　3.2　厌氧罐：带有双相压力表。
　　3.3　气袋法。
　　3.4　无菌平皿。
　　3.5　灭菌吸管。
　　3.6　相差显微镜。
　　3.7　三角瓶。
　　3.8　玻片染色缸或染色盘。
　　3.9　载玻片。
　　3.10　液氮罐。
　　3.11　厚壁毛细管。
　　3.12　水浴器：25±1℃，37±1℃和42±1℃各一台。
　　3.13　酒精灯。
　　3.14　灭菌试管。
　　3.15　接种针。
　　3.16　试管架。
　　4　培养基和试剂
　　4.1　蛋白胨水：按GB 4789.28中3.13规定。
　　4.2　Cary-Blair氏运送培养基：按GB 4789.28中4.52规定。
　　4.3　改良Camp-BAP培养基：按GB 4789.28中4.53规定。
　　4.4　Skirrow氏培养基：按GB 4789.28中4.54规定。
　　4.5　氧化酶试剂：按GB 4789.28中3.18规定。
　　4.6　3%过氧化氢液：按GB 4789.28中3.20规定。
　　4.7　1%甘氨酸培养基：按GB 4789.28中4.56规定。
　　4.8　30μg蒙啶酸圆形滤纸片。
　　4.9　三糖铁培养基：按GB 4789.28中4.26规定。
　　4.10　革兰氏染色液：按GB 4789.28中2.2规定。
　　4.11　TTC琼脂：按GB 4789.28中4.55规定。
　　4.12　马尿酸钠培养基：按GB 4789.28中3.9规定。
　　4.13　三氯化铁：按GB 4789.28中3.9规定。
　　4.14　快速硫化氢(H2S)试验琼脂：按GB 4789.28中4.50规定。
　　4.15　DNA酶甲基绿琼脂：按GB 4789.28中4.51规定。
　　5　检验程序
　　空肠弯曲菌检验程序如下：
　　（图略）
　　6　操作步骤
　　6.1　样品的采集及处理
　　不论那种食物样品都应尽快交付检验。如果样品必须运送和保存，应当使用Cary－Blair半固体培养基。弯曲菌的存活时间取决于温度，在25℃情况下，其存活时间不到24h或更少，因此样品在原始分离前需放冰箱或冷处保存。
　　6.2　微需氧条件的制备
　　最佳微需氧条件是氧气为5%、二氧化碳为10%、氮气为85%。
　　6.2.1　带有双相压力计(可表示正负压的)的厌氧罐：在装皿密封后，先抽去罐内空气至负压7.3×104Pa(550mmHg)处，输入上述三种混合气体使罐内压力恢复于零；再将罐内气体抽至负压7.3×104Pa(550mmHg)，同样输入上述气体至零，即可放置温箱培养。
　　6.2.2　气袋法：操作时只使用气体发生剂而不加催化剂。
　　6.2.3　双平板法：取两块平板，一块平板接种已知的兼性厌氧菌(如变形杆菌)，另一块平板接种样品，去掉皿盖，将含琼脂的两只皿相对合齐并用胶布粘封，放入密封不漏气的罐内(或袋内)进行培养。由于兼性厌氧菌生长的代谢作用，可使小环境中的氧气浓度下降和二氧化碳浓度上升。
　　6.2.4　蜡烛缸法
　　将已接种细菌的平板置于容量2000mL的磨口标本缸或干燥器内。缸盖及缸口涂以凡士林，放入小段点燃蜡烛于缸内(勿靠近缸壁，以免烤热缸壁而炸裂)，盖密缸盖。缸内燃烛约于0.5～1min，因氧减少自行熄灭，此时容器内约含二氧化碳5%～10%。最后连同容器一并置于42±1℃温箱中培养。
　　6.3　分离培养
　　6.3.1　拭子或液体可直接在选择性培养基如改良Camp－BAP布氏杆菌培养基或使用skirrow氏培养基平板上划线接种。于42℃培养48h后，观察可疑菌落。
　　6.3.2　第一型菌落不溶血，灰色、扁平、湿润、有光泽，看上去像水滴，有从接种线向外扩散的倾向；第二型菌落也不溶血，常呈分散凸起的单个菌落(直径为1～2mm)，边缘完整、发亮。
　　6.4　初步鉴定
　　将可疑菌落做氧化酶和过氧化氢酶试验，如为阳性，则涂片做革兰氏染色。本菌为革兰氏阴性菌，大小为0.3～0.4μm×1.5～3μm，呈S形、螺旋状或纺锤形。在固体培养基上培养时间过久或在不适条件下则常呈现球形菌。在暗视野或相差显微镜下观察，动力明显。根据菌落生长特征、菌体染色、动力、氧化酶和过氧化氢酶试验阳性者，可初步确定为弯曲菌。
　　6.5　确定鉴定
　　经初步鉴定后，仍需做下述试验(以下各项试验均需在5%氧气的微需氧环境中培养)。
　　6.5.1　甘氨酸(glycine)耐受性试验：接种于甘氨酸培养基中，培养48h，如为阳性，在培养基表面有云雾状生长，则为弯曲菌空肠亚种。
　　6.5.2　硫化氢生长试验：接种于TSI斜面上，并吊一根乙酸铅滤纸条于管口，培养物经48～72h培养，空肠弯曲菌一般在斜面上少量生长，其反应为碱性/碱性(K/K)，滤纸条变黑，但培养基底部不因硫化氢而变黑。
　　6.5.3　对3.5%氯化钠的耐受性试验：接种于3.5%含盐肉汤培养基，经48h培养，空肠弯曲菌不生长。
　　6.5.4　42℃和25℃生长试验：将培养物接种于两管布氏杆菌肉汤中，一管放于42℃下，一管放于25℃下培养48h，42℃生长而25℃不生长者，则为空肠弯曲菌。
　　6.5.5　马尿酸钠水解试验：将培养物接种于马尿酸钠培养基，于42℃培养48h，离心沉淀取出部分上清液。加入三氯化铁试剂，如出现恒久沉淀物则为阳性，空肠弯曲菌呈阳性反应。
　　6.5.6　萘啶酸(Nalidixic acid)试验：将可疑空肠弯曲菌涂布接种于血平板上，然后贴上含30μg萘啶酸的滤纸于平板上，空肠弯曲敏感而肠道弯曲菌不敏感。
　　6.5.7　TTC(2，3，5－氯化三苯四氮唑)试验：空肠弯曲菌在TTC培养基上呈阳性，而胎儿弯曲菌为阴性，阳性者有紫色菌苔并有光泽。
　　6.5.8　硝酸盐还原试验：取培养物的浓菌悬液，在37℃放置2h，加入试剂，观察颜色反应，空肠弯曲菌呈红色的阳性反应。
　　6.5.9　弯曲菌的生化鉴别见表1。
　　表1 弯曲菌属各个种的生化性状
　　（图略）
　　6.6　生物分型
　　6.6.1　快速马尿酸钠水解试验：将细菌接种在1%马尿酸钠0.4mL，37℃水浴2h，再加丙酮与丁酮溶液的3.5%茚三酮0.2mL，徐徐加入避免相混，放置10min后观察结果。深紫色为阳性，淡紫色或无色为阴性。
　　6.6.2　快速硫化氢(H2S)试验：取一环细菌悬浮于快速硫化氢半固体琼脂上1/3段，37℃水浴2h，观察结果，细菌团块周围变黑为阳性。
　　6.6.3　D NA酶水解试验：细菌点种于DNA酶甲基绿琼脂平板上，微需氧环境培养3～5d，菌苔周围出现无色透明环为阳性。生物分型结果见表2。
　　6.7　血清分型：空肠弯曲菌O因子分型应采用间接血凝法，H或K因子分型可用玻片凝集法。
　　表2 空肠弯曲菌等的生物分型
　　（图略）
　　6.8　菌种保存
　　空肠弯曲菌菌种应接种在改良Camp－BAP斜面培养基上(棉塞不宜过紧)，于42℃～43℃微需氧中培养48h后，置4℃冰箱微需氧内可保存10～14d，需要时仍可转种一次，长期保存用冻干法。
　　6.9　对空肠弯曲菌检验时，应严格执行无菌操作，防止自身感染。
　　附加说明：
　　本标准由卫生部卫生监督司提出。
　　本标准由中国进出口商品检验技术研究所负责起草。
　　本标准主要起草人孟洪德。
　　本标准由卫生部委托技术归口单位卫生部食品卫生监督检验所负责解释。

 

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