放线菌主要通过无性孢子进行繁殖。无性孢子主要有分生孢子和孢子囊孢子。也可借菌丝断片繁殖。
（1）分生孢子
放线菌长到一定阶段，一部分气生菌丝形成孢子丝，孢子丝成熟便分化形成许多孢子，称分生孢子。孢子的产生通过二种横隔分裂方式。
① 细胞质膜内陷，由外逐渐向内收缩并合成横膈膜，将孢子丝分隔成许多孢子。此为主要方式。
② 细胞壁与质膜同时内陷，逐渐向内缢缩，形成横隔壁，然后断裂形成一串孢子。诺卡菌属常以这种方式繁殖。
（2）孢子囊孢子
有的放线菌由菌丝盘卷形成孢子囊。其间产生横隔，形成孢子。孢子囊成熟后，释放出孢子。孢子囊可在气生菌丝、也可在基内菌丝上形成。
（3） 菌丝断片
放线菌也可藉菌丝断裂的片段，形成新菌丝体。这种现象常见于液体培养。工业发酵生产抗生素时，放线菌就以此方式大量繁殖。如果静止培养，培养物表面往往形成菌膜，膜上也可生出孢子。
（4） 其他方式
小单孢菌科（Micromonosporaceae）中多数种的孢子着生在直而短的营养菌丝的分叉顶端上，一个枝叉顶端形成一个球形、椭圆形或长圆形的孢子，这些孢子也称分生孢子。它们聚在一起，很像一串葡萄。某些放线菌偶尔也会产生厚壁孢子。
放线菌的孢子具有较强的耐干燥能力，但不耐高温，60～65°C处理10～15min即会失去生活能力。
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