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一、大肠菌群简介
有关大肠菌群，《GB 4789.3-2016 食品安全国家标准 食品微生物学检验 大肠菌群计数》中是这样定义的：“在一定培养条件下能发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧革兰氏阴性无芽胞杆菌”。一般认为该菌群细菌可包括大肠埃希氏菌、柠檬酸杆菌、产气克雷伯氏菌和阴沟肠杆菌等。
二、检验程序
对于大肠菌群的检验，《GB 4789.3-2016 食品安全国家标准 食品微生物学检验 大肠菌群计数》中提供了两种方法，MPN法和平板计数法。其中MPN法采用了两步发酵的方法，检验程序如下（图1）。本文主要对两步发酵方法中使用的两种培养基进行对比和讨论。
图1 大肠菌群 MPN 计数法检验程序
三、培养基比较
检测过程中所用的两款培养基，LST和BGLB比较如表1。
表1 LST和BGLB培养基的比较
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培养基 |
LST |
BGLB |
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中文名称 |
月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤 |
煌绿乳糖胆盐肉汤 |
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英文名称 |
Lauryl Sulfate Tryptose Broth |
Brilliant Green Lactose Bile Broth |
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用途 |
用于大肠菌群、大肠杆菌的测定。 |
用于大肠菌群的确证试验。 |
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配方（g/L） |
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检验原理 |
胰蛋白胨在培养基中作为营养物质提供菌体细胞生长所需要的氮源、维生素、氨基酸及生长因子等；乳糖是可发酵的糖类，提供菌体细胞生长所需要的碳源；氯化钠维持体系渗透压平衡；磷酸盐为菌体生长提供相对稳定的酸碱缓冲体系；月桂基硫酸钠抑制非大肠菌群类细菌的生长。 |
蛋白胨提供碳氮源；乳糖是可发酵的糖类；牛胆粉和煌绿抑制非肠杆菌科细菌。 |
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用法 |
称取本品35.6g，加热溶解于1000 mL蒸馏水中，分装到有小倒管的20 mm×150 mm试管中，每管10mL，121℃高压灭菌15分钟，备用。 |
称取本品40.0g，加热搅拌溶解于1000 mL蒸馏水中，分装到有倒立发酵管的20 mm×150 mm试管中，每管10 mL，121℃高压灭菌15分钟，备用。 |
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培养条件 |
36℃±1℃培养48h±2h |
36℃±1℃培养48h±2h |
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质量控制和典型特征 |
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大肠埃希氏菌 |
浑浊度2，气体充满管内1/3 |
浑浊度2，气体充满管内1/3 |
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弗氏柠檬酸杆菌 |
浑浊度2，气体充满管内1/3 |
浑浊度2，气体充满管内1/3 |
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阴沟肠杆菌 |
浑浊度2，气体充满管内1/3 |
浑浊度2，气体充满管内1/3 |
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鼠伤寒沙门氏菌 |
浑浊度2，不产气 |
浑浊度2，不产气 |
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金黄色葡萄球菌 |
浑浊度0（不生长） |
浑浊度0（不生长） |
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粪肠球菌 |
浑浊度0（不生长） |
浑浊度0（不生长） |
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质控图片 |
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产品选择 |
HB0102 月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤（LST） HB0102-3 双料月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤（LST） HBKD0102 月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤（LST）颗粒 HBKP0102 月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤（LST）（颗粒） HBPT017 月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤LST管（单料，含小倒管） HBPT017-1 月桂基硫酸盐蛋白胨肉汤LST管（双料，含小倒管） |
HB0104 煌绿乳糖胆盐肉汤（BGLB） HBKD0104 煌绿乳糖胆盐肉汤(BGLB)颗粒 HBKP0104 煌绿乳糖胆盐肉汤(BGLB)（颗粒） HBPT021 煌绿乳糖胆盐肉汤BGLB（含小倒管） |
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从表格中可以看出，这两种培养基中都含有乳糖，大肠菌群类的细菌都能利用这两种培养基发酵乳糖产生气体，使用方法也相同。但两者选用的抑菌剂不同：LST中月桂基硫酸钠是抑菌剂，抑制非大肠菌群类细菌的生长，而BGLB中则采用了牛胆粉和煌绿抑制非肠杆菌科细菌的生长。
两者选用的质控菌株一样：大肠菌群类细菌都能生长良好且产生气体，而沙门氏菌则只能生长，不会产生气体。
四、讨论
（1）因为这两种培养基选用的质控菌株完全一样，试验现象也完全一致，导致经常有人会问：只用LST进行发酵不行吗？为什么要用两步发酵？
首先，两步发酵都利用了乳糖发酵管进行了两次发酵试验，培养基的配制略有不同，但都是为了证实培养物是否符合大肠菌群的定义，即“在37℃分解乳糖产酸产气”。
初发酵试验也叫推测试验：样品稀释后，选择三个稀释度，每个稀释度接种三管LST肉汤，36℃±1℃培养48 h±2 h，观察是否产气。
复发酵试验也叫证实试验：将产气管培养物接种煌绿乳糖胆盐（BGLB）肉汤管中，36℃±1℃培养48 h±2 h，观察是否产气，以BGLB产气为阳性。
初发酵是样品的发酵结果，不是纯菌的发酵试验，所以初发酵阳性管经过后面的证实试验，有可能成为阴性。初发酵阳性管，不能肯定就是大肠菌群细菌。有数据表明，食品中大肠菌群检验步骤的符合率，推测试验与证实试验相差较大。因此，在实际检测工作中，证实试验是必需的。
类似两步发酵、两步增菌、同时用多种培养基对同一样品进行增菌分离的情况还有很多，通常来说，但凡标准里面这样要求，一定有其道理和必要性，所以建议操作人员严格按照标准程序进行检验，不要总想走捷径，使检出的结果不符合实际情况。相关文章可参考：
（2）产气量的判断
实验表明，大肠菌群的产气量，多者可以使发酵倒管全部充满气体，少者可以产生比小米粒还小的气泡。在乳糖发酵试验工作中，经常可以看到在发酵倒管内极微少的气泡（有时比小米粒还小），有时可看到在初发酵时产酸或沿管壁有缓缓上浮的小气泡。如果对产酸但未产气的乳糖发酵如有疑问时，可以用手轻轻打动试管，如有气泡沿管壁上浮，即应考虑可能有气体产生，并作进一步试验。
相关标准：
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