单核细胞增生李斯特氏菌检验

   
   1　主题内容与适用范围
　　本标准规定了单核细胞增生李斯特氏菌的检验方法。
　　本标准适用于食品和食物中毒样品中单核细胞增生李斯特氏菌的检验。
　　2　引用标准
　　GB 4789.28　食品卫生微生物学检验染色法、培养基和试剂
　　3　设备和材料
　　3.1　温箱30℃和25C。
　　3.2　天平。
　　3.3　500mL三角瓶。
　　3.4　接种环。
　　3.5　接种针。
　　3.6　载玻片。
　　3.7　盖玻片。
　　3.8　显微镜或相差显微镜。
　　3.9　平皿。
　　3.10　试管。
　　3.11　均质器。
　　3.12　无菌注射器。
　　3.13　吸管：1mL，10mL。
　　3.14　单核细胞增生李斯特氏菌标准株。
　　3.15　马红球菌。
　　4　培养基和试剂
　　4.1　含0.6%酵母浸膏的胰酪大豆肉汤(TSB－YE)：见附录A1。
　　4.2　含0.6%酵母浸膏的胰酪大豆琼脂(TSA－YE)：见附录A2。
　　4.3　EB增菌液：见附录A3。
　　4.4　LB增菌液(LB1，LB2)：见附录A4。
　　4.5　三糖铁(TSI)琼脂：GB 4789.28中4.26，4.27。
　　4.6　SIM动力培养基：见附录A5。
　　4.7　血琼脂：GB 4789.28中4.6。
　　4.8　改良的Mc Bride(MMA)琼脂：见附录A5。
　　4.9　硝酸盐培养基：GB 4789.28中3.17。
　　4.10　缓冲葡萄糖蛋白胨水(MR和VP试验用)：GB 4789.28中3.4。
　　4.11　糖发酵培养基：GB 4789.28中3.2。
　　4.12　过氧化氢酶试验：GB 4789.28中4.38。
　　4.13　盐酸吖啶黄(AcriflavineHCl)(Sigma)。
　　4.14　萘啶酮酸钠盐(Naladixicacid)(Sigma)。
　　5　检验程序
　　单核细胞增生李斯特氏菌检验程序如下：
　　（略）
　　6　操作步骤
　　6.1　样品的收集及处理
　　无菌采取样品25g(mL)放灭菌均质器中加225mLEB和LB增菌液中，充分搅拌成均质。如不能及时检验，可暂存4℃冰箱。
　　6.2　增菌培养
　　EB增菌液放30±1℃培养48h～7d，LB1增菌液225mL放30±1℃，培养24h，取出0.1mL，加入10mL LB2增菌液中二次增菌。
　　6.3　分离培养
　　将EB增菌液和LB2二次增菌液分离于选择培养基MMA琼脂平板上，培养30±1℃48h，挑选可疑菌落，用白炽灯45°角斜光照射平板，李斯特氏菌的菌落为灰蓝或蓝色，小的圆形的菌落。
　　6.4　选5个以上的上述可疑菌落接种三糖铁(TSI)琼脂和SIM动力培养基，培养于25±1℃，观察是否有动力，且成伞状或月芽状生长。一般观察2～7d，阳性者可做下一步鉴定。
　　6.5　纯培养
　　将上述有动力、形成伞状者并在三糖铁琼脂培基上层、下层的产酸而不产硫化氢的可疑培养物接种于胰酪胨大豆琼脂培养基(TSA－YE)上，做纯培养供做以下鉴定。
　　6.6　染色镜检
　　将上述可疑纯培养物做革兰氏染色并做湿片检查；李斯特氏菌为革兰氏阳性小杆菌，大小为0.4～0.5μm×0.5～2.0μm；用生理盐水制成菌悬液，在油镜或相差显微镜下观察，该菌出现轻微旋转或翻滚样的运动。
　　6.7　生化特性
　　将上述可疑菌做进一步的生化试验，单核细胞增生李斯特氏菌的主要生化特性及有关菌的区别见表1。
　　表1单核细胞增生李斯特氏菌生化性状与有关菌的区别
　　（表略）
　　6.8　对小鼠的致病力试验
　　将符合上述特性的纯培养物接种于TSB－YE中，在30℃培养24h，离心，浓缩，使浓缩液每毫升1010/mL个细菌，取0.5mL浓缩菌液注射小白鼠腹腔，3～5只，观察小鼠死亡情况。致病株于2～5d内死亡。试验时可用已知菌作对照。单核细胞增生李斯特氏菌、绵羊李斯特氏菌对小鼠有致病性。
　　6.9　协同溶血试验(cAMP)
　　在血平板上平行接种金黄色葡萄球菌和马红球菌(R.equi)，在它们中间垂直接种可疑李斯特氏菌，但不要触及它们，在30℃培养24～48h，检查平板中垂直接种点对溶血环的影响。靠近金黄色葡萄球菌接种点的单核细胞增生李斯特菌的溶血增强，西尔李斯特氏菌的溶血也增强，而绵羊李斯特氏菌在马红球菌附近的溶血增强，有助于鉴别。
　　
　　　　　　　　　　　　　　　　附录A
　　　　　　　　　　　　　　　 培养基
　　　　　　　　　　　　　　　(补充件)
　　A1　含0.6%酵母漫膏的胰酪胨大豆肉汤(TSB－YE)
　　A1.1　成分
　　胰胨　　　　　　　　　　　17g
　　多价胨　　　　　　　　　　3g
　　酵母膏　　　　　　　　　　6g
　　氯化钠　　　　　　　　　　5g
　　磷酸氢二钾　　　　　　　　2.5g
　　葡萄糖　　　　　　　　　　2.5g 
　　蒸馏水　　　　　　　　　　1000mL
　　A1.2　制法
　　将上述各成分加热搅拌溶解，调至pH7.2～7.4，分装，121℃灭菌15min，备用。
　　A2　含0.6%酵母膏胰酪胨大豆琼脂(TSA－YE)
　　A2.1　成分
　　胰胨　　　　　　　　　　　17g
　　多价胨　　　　　　　　　　3g
　　酵母膏　　　　　　　　　　6g
　　氯化钠　　　　　　　　　　5g
　　磷酸氢二钾　　　　　　　　2.5g
　　葡萄糖　　　　　　　　　　2.5g
　　琼脂　　　　　　　　　　　15g
　　蒸馏水　　　　　　　　　　1000mL
　　A2.2　制法
　　将上述各成分加热搅拌溶解，调pH至7.2～7.4，分装，121℃高压灭菌,备用。
　　A3　EB增菌液
　　A3.1　成分
　　胰胨　　　　　　　　　　　17g
　　多价胨　　　　　　　　　　3g
　　酵母膏　　　　　　　　　　6g
　　氯化钠　　　　　　　　　　5g
　　磷酸氢二钾　　　　　　　　2.5g
　　葡萄糖　　　　　　　　　　2.5g
　　蒸馏水　　　　　　　　　　1000mL
　　盐酸吖啶黄　　　　　　　　15mg/L
　　萘啶酮酸　　　　　　　　　40mg/L
　　A3.2　制法
　　除吖啶黄和萘啶酮酸外，其余成分加热混合调pH至7.2～7.4，121℃15min高压灭菌。使用前加吖啶黄溶液15mg/L和萘啶酮酸溶液40mg/L，此两种成分要无菌配制或过滤除菌。
　　A4　李氏增菌肉汤(LB1，LB2)
　　A4.1 成分
　　胰胨　　　　　　　　　　　5g
　　多价胨　　　　　　　　　　5g
　　酵母膏　　　　　　　　　　5g
　　氯化钠　　?　　　　　　　?g
　　磷酸二氢钾　　　　　　　　1.35g
　　磷酸氢二钠　　　　　　　　12g
　　七叶苷　　　　　　　　　　1g
　　蒸馏水　　　　　　　　　　1000mL
　　A4.2　制法
　　将上述成分加热溶解，调pH至7.2～7.4，分装，121℃15min高压灭菌。
　　A4.2.1　李氏I液(LB1)225mL中加入：
　　1%萘啶酮酸(用0.05mol/L氢氧化钠溶液配制)　　 0.45mL
　　1%吖啶黄(用灭菌蒸馏水配制)　　　　　　　　　0.27mL
　　A4.2.2　李氏Ⅱ液(LB2)200mL中加入：
　　1%萘啶酮酸　　　 0.40mL
　　1%吖啶黄　　　　 0.50mL
　　无菌分装于10mL大试管中。
　　A5　改良的Mc Bride琼脂(MMA)
　　A5.1　成分
　　胰胨　　　　　　　　　　　5g
　　多价胨　　　　　　　　　　5g
　　牛肉膏　　　　　　　　　　3g
　　葡萄糖　　　　　　　　　　1g
　　氯化钠　　　　　　　　　　5g
　　磷酸氢二钠　　　　　　　　1g
　　苯乙醇　　　　　　　　　　2.5mL
　　无水甘氨酸　　　　　　　　10g
　　氯化锂　　　　　　　　　　0.5g
　　琼脂　　　　　　　　　　　15g
　　蒸馏水　　　　　　　　　　1000mL
　　A5.2　制法
　　将上述成分加热搅拌混匀，调pH至7.2～7.4，分装，121℃ 15min高压灭菌，备用。
　　A6　SIM动力培养基
　　A6.1　成分
　　胰胨　　　　　　　　　　　20g
　　多价胨　　　　　　　　　　6g　　
　　硫酸铁铵　　　　　　　　　0.2g
　　硫代硫酸钠　　　　　　　　0.2g
　　琼脂　　　　　　　　　　　3.5g
　　蒸馏水　　　　　　　　　　1000mL
　　A6.2　制法
　　将上述各成分加热混匀，调pH7.2，分装小试管，高压灭菌121℃ 15min。
　　附加说明：
　　本标准由卫生部卫生监督司提出。
　　本标准由卫生部食品卫生监督检验所负责起草。
　　本标准主要起草人白竟玉、付萍、李志刚。
　　本标准由卫生部委托技术归口单位卫生部食品卫生监督检验所负责解释。
　　本标准参照采用美国食品药品管理局(FDA)细菌学分析手册(第六版)增补材料第二十九章李斯特氏菌部分(1987)。

 

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