重组体的筛选

  目的基因和载体重组并进入宿主细胞后，由于操作失误及不可预测因素的干扰等，并不能全部按照预先设计的方式重组和表达，真正获得目的基因并能有效表达的克隆子只是其中的一小部分，绝大部分仍是原来的受体细胞，或者是不含目的基因的克隆子。为了从处理后的大量受体细胞中分离出真正的克隆子，目前已建立起一系列的筛选和鉴定方法。

  重组体筛选的方法很多，归纳起来可分为两种：在核酸水平或蛋白质水平上筛选。从核酸水平筛选克隆子可以通过核酸杂交的方法。这类方法根据DNA-DNA、DNA-RNA碱基配对的原理，以使用基因探针技术为核心，发展了原位杂交、Southen杂交、Northen 杂交等方法。从蛋白质水平上筛选克隆子的方法主要有：检测抗生素抗性及营养缺陷型、观测噬菌斑的形成、检测目标酶的活性、目标蛋白的免疫特性和生物活性等。

  无论采用哪一种筛选方法，最终目的都是要证实基因是否按照人们所要求的顺序和方式正常存在于宿主细胞中。

  利用抗生素抗性基因筛选

  这是一种最早发展而且目前仍广泛使用的方法。在DNA重组载体设计时已经在质粒中装配了抗生素抗性基因标记，如四环素抗性基因（Tetr）、氨苄青霉素抗性基因（Ampr）、卡那霉素抗性基因（Kanr）等。当编码有这些抗药性基因的质粒携带目的基因进入宿主细胞后，细胞就具有了相应的抗生素抗性，如果在筛选平板的培养基中加入有关抗生素，只有含质粒的细胞才能生长。这种方法只能证明细胞中确实已经有质粒存在，但无法保证质粒中已经携带了目的基因。为了防止误检，人们进一步发展了采用插入缺失的方法，同一质粒中往往有两种抗药性基因，在体外重组时故意将目的DNA插入到其中一个抗性基因中，使其失活，这样得到的宿主细胞便可在含另一抗生素的培养基中存活，但在两种抗生素都加入的平板上则不能生长。将这种菌株筛选出来，就能保证细胞中的重组质粒确实已经插入了目的基因。由于需要两次筛选，操作比较麻烦。

  例如pBR322质粒上有两个抗生素抗性基因，抗氨苄青霉素基因（Ampr）上有单一的PstI位点，抗四环素基因（Tetr）上有SalI和BamHI位点。当外源DNA片段插入到SalI/BamHI位点时，使抗四环素基因失活，这时含有重组体的菌株从AmprTetr变为AmprTet8。这样，凡是在Ampr平板上生长而在AmprTetr平板上不能生长的菌落就可能是所要的重组体。

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