质粒设计对目的基因表达的影响

影响外源DNA转录的主要因素是启动子的强弱。启动子是DNA序列中与宿主细胞的RNA聚合酶专一结合并起始转录合成mRNA的部位。大多数外源的特别是真核细胞的启动子不能被大肠杆菌RNA聚合酶识别，因此必须将外源基因置于大肠杆菌启动子控制下。Lac、LacUV5、Tac等都是常用的强启动子。但是太强的启动子在启动外源基因表达时可能严重损害重组菌的正常生长代谢，因而需要选择合适的启动子。转录终止信号也会影响转录，人工合成的基因一定要装配合适的终止子，以减少能量消耗及保持转录的准确性。

翻译水平影响外源基因表达的重要因素是翻译起始区。翻译是在核糖体上进行的，因此mRNA上必须有核糖体的结合部位（称SD序列）。由于密码子的简并性，同一种氨基酸可以有不同的密码子翻译得到，每种宿主细胞都有其偏爱的密码子，对于人工合成基因来说，应该对密码子进行优化，采用宿主菌偏爱密码子代替稀有密码子，同时保持嘌呤和嘧啶碱基配对反应的能量平衡。翻译后的加工修饰也将影响表达水平，包括切除新生肽键N端甲酰蛋氨酸、形成二硫键、糖基化和肽键本身的后加工等。

在基因工程诞生后研究开发第一代重组DNA产品时，发现在大肠杆菌细胞内表达的胰岛素的产量很低。经过深入研究，发现这些表达的蛋白质大部分都被细胞内蛋白酶降解了。但当目标产物与β-半乳糖苷酶融合表达时，不会被蛋白酶降解，使融合蛋白产物能在细胞内高水平积累，从而产生了目的基因高效融合表达的新方法。融合表达的蛋白质没有生物活性，但在质粒设计时已经预先考虑了酶切或化学方法的切割位点，可以很容易地将融合的一段肽链切除后恢复目标蛋白的活性。该方法的表达产量高，已得到了广泛应用。

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