菌种保藏的原理和方法

1、菌种保藏原理

选用优良的纯种，最好是休眠体（分生孢子、芽孢等），创造一个是微生物代谢不活泼，生长繁殖受抑制，难以突变的环境条件。其环境要素是干燥、低温、缺氧、缺营养以及添加保护剂等。

2、菌种保藏常用方法

（1）定期移植保藏法

将菌种接种于适宜的斜面或液体培养基，也可进行穿刺培养，待生长成健壮的菌体（对数期细胞、有性孢子或无性孢子）后，将菌种放置4℃冰箱保藏，每间隔一定时间需重新移植培养一次。芽孢杆菌每 3~6个月移种一次，其他细菌每月移种一次。此方法最早使用且至今仍普遍使用。

（2）液体石蜡保藏法

在生长良好的斜面表面覆盖一层无菌的液体石蜡，液面高出培养基1cm，将其置试管架上以直立状态低温保藏。此方法是定期保藏法的补充。

（3）沙管保藏法、土壤保藏法

取河沙过24目筛。用10%-20%的盐酸没泡除去有机质，洗涤，烘干，分装入安瓿管，加塞灭菌。需要保藏的菌株先用斜面培养基培养，再用无菌水制成细胞或孢子悬液，将10滴悬液注入装有洗净、灭菌河沙的沙管内，使细胞或孢子吸附在沙上，放到干燥器中吸干沙中的水分，将干燥后的沙管用火焰熔封管口。可以室温或低温保藏。土壤法以土壤代替河沙，不需酸洗，经风干、粉碎、过24目筛，分装灭菌后，同上制备。此法适用于芽孢杆菌，梭状芽孢杆菌、放线菌和一些丝真菌的保藏。

（4）麸皮保藏法

或称曲法保藏，将麸皮(也可用各种谷物代替）水或其他培养基成分以一定的比例拌匀，加水或培养液与麸皮的比例为1:0.8或1:1克1:1.5，原则是按照不同菌种对水分要求不同而定。将拌匀的麸皮分装在试管或安瓿管等容器中，装入的麸皮应保特疏松，不要紧压。高温灭菌后，将随种的孢子液接入。适宜温度下培养，直至长出菌丝。再放在干燥器中干燥后，20℃以下温度保藏。也可将小管用火焰熔封。常用于放线菌和霉菌的保藏。

（5）蒸馏水保藏法

每个试管中装5ml灭菌的无菌水，用接种针从斜面或平板上挑取一环菌种细胞，接入蒸馏水中并使之悬浮，试管用无菌的橡皮塞塞紧，放置10℃低温保藏。需用时，可从管内移出一环接到培养基上，而原来的管加塞后仍可继续保藏。此法是最简单的保藏方法。

（6）冷冻干燥保藏法

将菌液在冻结状态下升华其中水分，最后获得干燥的菌种样品。此方法是目前被广泛推崇的方法。

（7）液态超低温保藏法

将菌种悬浮封存于圆底安瓿管或塑料的液氮保存管（材料应耐受较大温差骤然变化）内，放到-196℃~-150℃的液氮罐或液氮水箱内保藏。此方法已被公认为当前最有效的菌种长期保存技术之一，适用范围最广的微生物保藏法。

（8）甘油保藏法

菌种悬浮在10%（体积分数）甘油蒸馏水，置低温（-80~70℃）保藏。实际中，常将待保藏菌培养至对数期的培养液直接加到已灭过菌的甘油中，并使甘油的终浓度在10%~30%左右，再分装于小离心管中，置低温保藏。基因工程常用此法保藏。

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